ipt基因在植物基因工程中的应用

陈梦莹，陈祥福，崔萌，魏娟娟，潘阳露，潘宇，李金华，张兴国

（西南大学园艺园林学院，重庆市蔬菜学重点实验室，重庆，400715）

ipt基因在植物基因工程中的应用

陈梦莹，陈祥福，崔萌，魏娟娟，潘阳露，潘宇，李金华，张兴国

（西南大学园艺园林学院，重庆市蔬菜学重点实验室，重庆，400715）

异戊烯基转移酶IPT是细胞分裂素生物合成过程中的限速酶，其编码基因ipt已被克隆并得到广泛应用。简要介绍了在植物遗传转化中控制ipt表达的启动子，综述了ipt在植物基因工程中的应用，并分析了目前ipt基因在植物基因工程应用中存在的一些问题。

异戊烯基转移酶基因（ipt)；植物基因工程

细胞分裂素（Cytokinin，CTK）是促进细胞分裂的激素，在植物生长发育过程中行使重要功能，如参与细胞分裂、光合作用、衰老及营养代谢等过程。1963年，Letham从未成熟的甜玉米中发现并纯化得到细胞分裂素，俗称玉米素（Zeatin），这与先前报道Miller从玉米中分离但未完全纯化的细胞分裂物质相同[1]。细胞分裂素从化学角度看主要分为两类，一类是在天然细胞分裂素异戊烯腺嘌呤N6位上进行取代，侧链通常为芳香环衍生物或类异戊二烯基，包括6-呋喃甲基腺嘌呤（KT）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）等，称嘌呤型细胞分裂素；另一类为苯基脲型细胞分裂素，即N，N'-二苯基脲（DPU）以及一些苯基脲的衍生物，如噻重氮苯基脲、N-（4-吡啶基）N'-苯基脲、N-苯基-N'-（2-氯-4-吡啶基）脲等。目前，在细胞分裂素生物合成过程中起关键作用的一些酶的特性已得到研究，有些还被克隆出了对应的基因[2]。其中，异戊烯基转移酶（Isopentenyl-transferase，IPT）是植物细胞分裂素生物合成中的限速酶。异戊烯基转移酶基因最初在根癌农杆菌中得到鉴定，命名为tmr，后称为ipt，IPT酶的活性也逐步在多种植物的粗提取物中被检测到[3，4]。随着拟南芥基因组测序工作的完成，编码IPT的基因家族也被证实，包括9个成员证明除以外，其他7个基因能够编码大肠杆菌中细胞分裂素的生物合成[5]。异戊烯基转移酶基因（ipt）的广泛应用，对深入了解细胞分裂素的生理作用及通过植物基因工程技术控制植物生长发育方面具有重要意义，也使植物激素的基因工程在遗传育种中的应用方面展现了新的作用。

1 基因工程中ipt基因表达的调控

早期研究发现，使用IPT和花椰菜花叶病毒（CaMV）35S这两种启动子控制ipt基因在转化植株中表达，发现其控制下的ipt基因均组成型过量表达，产生的细胞分裂素浓度较高，从而导致一系列反常的发育，如抑制茎伸长、丧失顶端优势、抑制侧根形成、表现矮化及形成小圆叶[6～8]。为解决该问题，各类非组成型表达启动子被用来控制ipt基因的表达（表1），使其表达水平、表达的空间和时间受到限制。

表1 ipt在植物基因工程中使用的启动子

2 提高转化效率

细胞分裂素能促进植物组织的分化和生长，是诱导植物不定芽分化的关键激素。当烟草等植物表达外源ipt基因时，不定芽再生得到了促进[10]。ipt基因促进了矮牵牛遗传转化中不定芽的诱导，不定芽诱导率显著高于对照[8]。这种效应已用来解决难以再生植物的离体分化问题。当 基因转入杜仲后，其不定芽诱导率为2.95%，比未转ipt基因的对照有明显增加，说明ipt作为外源基因转入不定芽诱导困难的植物杜仲，提高了其遗传转化效率[12]。

3 作为选择标记基因

ipt基因表达能促进不定芽分化并导致转基因植物表型反常变化，具有诱导表型效应。因此，ipt可作为简单表型标记来筛选转化子，直观地指示是否得到转基因植株[22]。使用ipt基因作为选择标记，使转基因组织能在没有细胞分裂素的培养基上完成分化[29]。将35S-ipt基因与卡那霉素同时使用时，转化效率比单独使用卡那霉素提高1.6倍，说明抗生素与ipt结合使用效果会更好[30]。

使用位点特异性重组系统，无ipt等选择标记的转基因系统已建立。拟南芥热激启动子hspl8.2可驱动flp重组酶基因，从而热诱导删除外源基因，当与ipt基因串联后，获得转基因植株后进行热激处理，删除ipt标记基因，使植物的生长发育恢复正常[8]。Cre重组酶系统可以从转基因柑橘中高效删除ipt标记基因，达到非常高的删除效率[11]。利用重组酶系统删除转基因植物中的筛选标记基因等外源基因，可消除人们对转基因植物的安全顾虑，是目前转基因安全控制的研究方向之一。

4 延缓衰老

在20世纪30年代末就有科学家发现细胞分裂素可以延缓叶片衰老。有研究表明，细胞分裂素是一种有效的抗衰老调节剂，其作用机理主要涉及以下几个方面：a.提高细胞外转化酶的活性；b.促进活性氧的清除，以减缓脂质氧化程度而延缓衰老；c.降低对乙烯和ABA的敏感性[31]。

有研究发现，通过基因工程手段将ipt基因导入植物中，可以控制植株的生长和衰老。Smigocki等[32]用融合基因转化烟草，延迟了整个植株的衰老。张赛群等[13]通过根癌农杆菌介导，构建嵌合基因，并对5个番茄品种进行遗传转化，最后获得来自31个不同外植体的44棵转化再生植株，对其中一部分单株进行PCR检测证明为转基因植株，观察其田间生长状况，发现其生长旺盛并表现出抗叶片衰老的特性。张治礼等[15]将嵌合基因导入樱桃番茄，对其中14株转化植株与对照中的2株进行叶片叶绿素、细胞分裂素检测，结果表明，与对照相比，不同叶位的叶片叶绿素、细胞分裂素含量显著提高，而同一叶位的叶片则与对照相比延缓15～20 d衰老。Lai等[33]研究了聚乙二醇渗透胁迫对转大丁草叶片中抗氧化酶活性的影响，抗氧化酶活性被激活后，在转基因植株中的活性比未转基因对照提高很多，说明渗透胁迫诱导的延缓叶片衰老是抗氧化酶活性增高引起的。利用根癌农杆菌介导法将嵌合基因导入棉花中，经过卡那霉素抗性筛选和检测共获得9个转基因株系，后期测定结果表明，叶片细胞分裂素、叶绿素及可溶性蛋白等的含量明显高于对照，转基因棉花叶片衰老得到延缓[34]。Huo等[25]使用大豆GmSARK启动子来调控ipt基因表达，qRT-PCR的结果表明ipt基因在转基因拟南芥中的表达受衰老的特异性控制，并延缓了叶片衰老。

5 参与防御反应

与其他植物激素类似，细胞分裂素在植物遭受逆境胁迫时能够及时响应并调控植物的生长发育。此外，细胞分裂素还可以与其他内源激素共同参与反应，通过使植物体内的生理产生变化来避免植物受病虫害干扰等。在与一些逆境胁迫相关的蛋白方面，细胞分裂素对其诱导和调控也起着重要作用。

ipt基因在转基因水稻中表达，使叶绿素含量增加、光合作用增强，使根系保持较高的活力，增强根对营养物质和矿质元素的吸收和利用，也抵御了低温的为害[35]。逆境启动子rd29A在4℃低温诱导12 h时，能够很好地调控ipt基因的表达，使烟草外植体在遭受逆境胁迫时也能正常分化，达到较高的抗性愈伤诱导率[24]。刘丽君等[36]在转基因的大豆中，通过内源IAA、ABA含量的增加，SOD酶活性增强，MDA（丙二醛）含量减少，来改变大豆的形态以提高抗病性。玉山江等[37]对 ipt转基因籼稻植株进行干旱胁迫，发现其细胞分裂素含量和叶绿素含量显著高于野生型，很大程度上延缓了茎叶衰老，叶片温度显著低于野生型。孙雷心[38]通过马铃薯创伤诱导启动子调控改良过的细胞分裂素基因在植物中表达，可使植物在仅遭受食害或创伤时产生该种激素并促进了伤口愈合，与导入抗虫基因相比更接近于植物的天然防御能力。

6 指导有机物质的积累与分配

细胞分裂素可以指导植物中有机质的分布，这为改良作物品质及提高蛋白含量提供了一种可能的途径。毛自朝等[17]将果实特异性启动子2A12控制的ipt基因在番茄中表达，发现果实中细胞分裂素含量增高从而使果实中胎座组织增厚和种子发育停滞，最后得到无籽番茄果实；由于ipt基因的表达使果实成熟过程受阻，也使得果实采后储藏时间延长了10 d左右，随后研究发现，转基因番茄的坐果率和产量都有不同程度的提高，可溶性糖含量略低，但果实中粗蛋白和干物质含量都有明显增高。王亚琴等[39]将叶片衰老抑制基因经基因枪导入籼稻，转基因植株的有效穗数和千粒质量比对照显著增加，说明其在延缓叶片衰老的同时能提高叶片利用光能的时间，从而积累大量的光合产物。小麦高分子量麦谷蛋白亚基12启动子与ipt基因嵌合后转化烟草，使细胞分裂素含量有所增加，且少量细胞分裂素的异常表达在一定程度上使贮藏同化累积增加[40]。

7 诱导单性结实

单性结实是指在天然或人工作用下使胚珠不经授粉而子房发育形成果实的现象。在胚珠未经受精的情况下，可形成无籽果实。生长素、脱落酸和赤霉素等植物激素对单性结实有显著的影响，且各激素的平衡比单一激素对单性结实的影响效应要大。环境因子如温度、光照等也会通过影响植物激素的合成从而间接影响单性结实。利用果实特异性启动子在番茄中大量表达ipt基因能得到稳定的单性结实株系[41]。

8 产生雄性不育后代

利用植物雄性不育为基础的杂种优势已成为许多作物育种的重要目标和方向。到目前为止，利用转基因的方法获得植物雄性不育材料已有很多研究。在花药发育到花粉粒成熟过程中有一系列基因的表达，这些基因的异常表达往往导致部分或全部的花粉败育。利用花药绒毡层特异性启动子TA29调控ipt基因的表达，可使转基因植株雄蕊中细胞分裂素的含量比对照高出3～4倍，让原本花药发育过程中平衡的激素环境发生紊乱，进而使花药和花粉的正常发育受阻，最后获得雄性败育株系[16]。

9 问题与展望

综上所述，到目前关于ipt基因在植物转基因中应用的实例已有很多，但仍存在一些问题：

①特异性启动子控制ipt基因的表达在烟草、番茄等双子叶植物上的应用较多，而在单子叶植物和多年生植物中的应用相对较少。不同启动子间的研究也存在差异，如衰老组织特异表达启动子SAG12的研究应用相对较多，但其他特异性启动子的研究则较少。

②对转ipt基因植株中细胞分裂素与生长素的相互作用机制及激素对植物生长发育的影响等方面仍需进一步探索。

③大部分转ipt基因的研究仍处于植株转化阶段，对转基因植株的生理方面没有进行深入研究。在 延迟衰老方面，除了发现延缓下部叶片脱落和细胞分裂素含量增加外，一些转化植株还存在着许多与野生型不同的特征。因此，在这方面还有待改善并加强分子水平的解释。

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Application of ipt Gene in Plant Genetic Engineering

CHEN Mengying,CHEN Xiangfu,CUI Meng,WEI Juanjuan,PAN Yanglu, PAN Yu,LI Jinhua,ZHANG Xingguo

Isopentenyl-transferases(IPT)catalyze the first and rate-limiting step of cytokinin biosynthesis,and its coding genes have been cloned and used widely.This paper introduced the promoters controlling the expression of ipt gene in plant genetic transformation briefly,and reviewed the application of ipt in plant gene engineering,at the same time,the paper analyzed the related existing problems.

Isopentenyl-transferase gene(ipt);Plant genetic engineering

Q943.2

A

1001-3547（2014）16-0009-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2014.16.002

科技部“863”项目资助（2010AA10060705)

陈梦莹（1990-)，女，硕士，研究方向为蔬菜分子生物学与基因工程，电话：18883734633，E-mail：meng.ying.2009@163.com

张兴国，通信作者，研究员，从事蔬菜分子生物学与遗传育种研究，E-mail：zhangxg63@163.com

2014-06-23