HPLC 法测定明党参组织培养物和栽培品中香豆素成分的含量

步 达，姚 晓，郑紫婷，李 祥，陈建伟

南京中医药大学，南京 210023

明党参Changium smyrnioides Wolff 为伞形科(Umbellifarae)多年生草本植物，去皮的根供药用。始载于明、清时期，为现版《中国药典》的名贵中药之一。分布于江苏、安徽、浙江、江西、湖北等省，江苏为地道药材产区。外形和疗效似人参，具润肺化痰、养阴和胃、平肝解毒之功效，为我国重点保护的珍稀濒危植物［1］。7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素和珊瑚菜内酯均是从明党参中分离得到的香豆素类化合物，药理研究表明，这四种香豆素类化合物具有明显的抗肿瘤作用和抗氧化作用［2］。目前国内外对明党参根、茎叶、果实的研究已有文献报道［3-6］，但对明党参组培产物中香豆素成分的含量测定尚未见报道，本研究建立了同时测定四种香豆素成分含量的测定方法，并比较了其在组培和栽培品不同部位的含量，为其资源的合理开发与利用提供科学依据。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

实验材料于2012 年9 月采自南京市仙林羊山，经南京中医药大学中药资源学教研室陈建伟教授鉴定为明党参Changium smyrnioides Wolff。鲜根带土移栽到南京中医药大学药苑中，在自然情况下培养。根据之前9 种激素条件下对明党参叶片愈伤情况的优选，采用培养基组成为MS+2，4-D 0.5mg/L +KT 0.2 mg/L+NAA 1.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L;MS+2，4-D 1.0 mg/L+KT 0.1 mg/L+NAA 1.5 mg/L+6-BA1.5 mg/L 进行明党参叶片的愈伤组织诱导和根诱导，并将愈伤组织和根诱导产物取出干燥备用。

1.2 仪器

Agilent 1100 液相色谱仪，自动进样器，HT-230A 柱温箱(HENGAoT ＆ D)，配Agilent-C18 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，Agilent 公司;KQ-500DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);HH-S 恒温水浴锅(江苏国胜实验仪器厂);FA-1004 电子分析天平(上海天平仪器厂);LIBRORAEL-40SM 电子分析天平(SHIMADZU);岛津UV-2401 紫外扫描仪。

1.3 试剂

对照品7-羟基香豆素(批号:20120327)、花椒毒酚(批号:20110819)和欧前胡素(批号:20110520)由上海源叶生物科技有限公司提供，所有对照品经HPLC 峰面积归一化法检测质量分数均在98%以上;珊瑚菜内酯为本实验室从明党参果实中分离所得到，经UV、IR、MS、1H NMR、13C NMR 鉴定确定为珊瑚菜内酯，熔点103～104 ℃，面积归一化法测得对照品纯度为99.7%。乙腈(色谱纯，美国天地有限公司);水为双蒸水，其他试剂均为分析纯(南京化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取对照品7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素和珊瑚菜内酯13.03、13.02、12.08、15.53 mg，分别加甲醇超声(300 W，40 kHz)溶解并定容，即得浓度分别为260.6、260.4、241.6、310.6 μg/mL 的对照品储备液。分别精密移取对照品储备液5、20、5、5 mL，用甲醇稀释至7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素和珊瑚菜内酯分别为50.12、13.02、57.29、68.33 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取干燥供试品粉末(过3 号筛)约1.0 g，精密称定，置于50 mL 烧瓶中，加入甲醇50 mL，80 ℃加热回流1 h，过滤，50 ℃减压干燥，用20 mL 乙酸乙酯-蒸馏水(1∶1，V/V)萃取，共萃取3 次，合并乙酸乙酯层，50 ℃减压干燥，用甲醇定容至10 mL，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱为Agilent-C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-水(B)梯度洗脱程序:0～5 min，5% A;5～10 min，5%～35%A;10～15 min，35%～60%A;15～40 min，60%～85%A;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长314 nm;分析时间40 min;进样量为10 μL。在上述条件下，7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素及珊瑚菜内酯理论板数均不低于8000。对照品和供试品的色谱图，见图1。

图1 对照品及其供试品的HPLC 色谱图Fig.1 Overlaid HPLC chromatograms of mixed standards(D)and samples (G1-G9)

2.4 线性关系

分别精密移取“2.1.1”项下7-羟基香豆素对照品储备液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度;花椒毒酚对照品储备液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度;欧前胡素对照品储备液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度;珊瑚菜内酯对照品储备液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度。按“2.2”项下的色谱条件，分别进样10 μL，记录峰面积。以峰面积Y(A)为纵坐标，浓度X(mg/mL)为横坐标，进行线性回归，得到7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素及珊瑚菜内酯线性回归方程及线性关系，见表1。

表1 4 种香豆素类成分的线性关系Table 1 Linear relationships of 4 investigated coumarin

2.5 精密度试验

精密移取混合对照品溶液10 μL，按“2.2”项下色谱条件重复进样6 次，以峰面积计算7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素及珊瑚菜内酯RSD 分别为1.50%、2.17%、2.56%、2.50%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，分别于0、2、4、6、8、12 h 进样测定，记录色谱图，考察峰面积的变化，结果7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素及珊瑚菜内酯面积的RSD 分别为1.01%、2.56%、1.91%、2.29%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同批次明党参愈伤组织粉末，按“2.1.2”项下方法制备6 份供试品溶液，以“2.2”项下色谱条件进行含量测定，结果7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素及珊瑚菜内酯的平均含量分别为0.5402、0.2836、0.0104、0.0143 mg/g，RSD 分别为1.54%、2.86%、2.75%、2.53%，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量明党参愈伤组织粉末约1.0 g，共9 份，精密移取7-羟基香豆素对照品(260.6 μg/mL)1.5、2.0、2.5 mL、花椒毒酚对照品(260.4 μg/mL)0.8、1.2、1.6 mL、欧前胡素对照品(241.6 μg/mL)0.02、0.03、0.04 mL、珊瑚菜内酯对照品(310.6 μg/mL)0.03、0.04、0.05 mL 的储备液，并按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，计算回收率。结果见表2～5。

表2 7-羟基香豆素加样回收率试验结果Table 2 Recovery results of 7-hydroxycoumarin

表3 花椒毒酚加样回收率试验结果Table 3 Recovery results of xanthotoxol

表4 欧前胡素加样回收率试验结果Table 4 Recovery results of imperatorin

表5 珊瑚菜内酯加样回收率试验结果Table 5 Recovery results of phellopterin

2.9 供试品的含量测定

取9 批供试品，按“2.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.2”项下色谱条件测定，并计算7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素及珊瑚菜内酯的平均含量，结果见表6。

表6 不同供试品明党参中7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素及珊瑚菜内酯的含量Table 6 Determination of 7-hydroxycoumarin，xanthotoxol，imperatorin and phellopterin in different samples of C.smyrnioides (mg/g，n=3)

3 讨论

3.1 波长的选择

本实验参照文献［8，9］建立了多香豆素类成分同时测定的方法，如图1 和表1 所示，在314 nm 波长处7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素、珊瑚菜内酯具有良好的分离度和线性关系，能满足明党参药材及组织培养物中多种香豆素成分的同时测定。在实际实验中还选择了268 nm 进行了监测，但综合考虑灵敏度、稳定性等因素，故使用314 nm 作为定量波长。

3.2 供试品溶液制备方法的选择

经过超声处理及加热回流2 种方法的对比实验，结果表明加热回流提取香豆素类成分的含量较高，故选取加热回流提取法。比较了乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇等6 种提取溶剂，结果表明，采用甲醇作为提取溶剂，提取效率最高。经20、30、40、60、90 min 回流时间比较表明，回流提取60 min 时，即可达到平衡。

3.3 流动相的选择

本实验比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸-水、乙腈-磷酸-水、甲醇-醋酸-水、乙腈-醋酸-水系统及梯度洗脱条件下对样品中花椒毒酚、欧前胡素、珊瑚菜内酯、7-羟基香豆素分离度的影响，结果表明采用乙腈-水梯度洗脱时4 种香豆素类能得到良好的分离。

3.4 明党参及其组织培养产物中香豆素类成分的累积规律分析

由表6 可见，7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素在9 份供试品中均有累积，珊瑚菜内酯除愈伤组织根诱导产物中未检出外，其余8 份均有累积，除欧前胡素外，其余三者在栽培品根皮部的含量最高，表明其成分在根中主要积累在根皮部;此外，明党参栽培品的茎叶中4 种香豆素类成分均有累积，提示明党参传统工艺弃之根皮和叶具有再利用价值。除花椒毒酚外，栽培明党参中其余3 种香豆素含量明显高于野生品，这为野生变家种，扩大药用资源提供了一定依据。

3.5 明党参不同组织培养产物中香豆素形成的分析

本实验首次对明党参组织培养两个阶段中的产物进行了高效液相色谱含量检测，从表6 中可以看出，明党参愈伤组织和愈伤组织根诱导的产物中7-羟基香豆素、花椒毒酚、欧前胡素、珊瑚菜内酯均有累积，表明在明党参愈伤组织形成阶段已具有合成4 种香豆素类成分的能力，且前3 种成分在根诱导产物中的含量均高于愈伤组织，提示随着明党参愈伤组织再分化的进行，香豆素类成分的生物合成累积量也随之增多;但是在根诱导产物中尚未检测出珊瑚菜内酯，是否与缺少异戊烯转移酶和O-甲基转移酶有关，原因有待进一步研究。

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