以Hsp90 为靶点的4-(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)姜黄素抗肿瘤活性研究

刘 洋，李 娜，吴丽贤，许建华

1福建医科大学药学院药物化学系，福州 350108;2福建医科大学附属协和医院药剂科，福州 350001;3福建医科大学药学院药理学系;4 福建省天然药物药理学重点实验室 福建医科大学新药研究所，福州 350108

热休克蛋白90(Hsp90)是ATP 依赖的分子伴侣，能够稳定很多客户蛋白，其中有肿瘤生长增值所必需的许多蛋白，例如Her2、BCR-ABL 和IKK 等。Hsp90 已成为重要的抗肿瘤靶点［1］。第一代天然Hsp90 抑制剂有格尔德霉素(GDA)，根赤壳菌素Radicicol(RD)及它们的衍生物。第二代合成Hsp90抑制剂主要是以嘌呤或间苯二酚为骨架的小分子化合物，有17 个已进入临床研究［2］。但由于有毒性大，生物利用度和水溶性差等缺点，至今没有一个Hsp90 抑制剂被批准上市。发现新化学骨架的Hsp90 抑制剂具有重要意义。

姜黄素(curcumin，Cur)为天然植物姜黄中的主要抗肿瘤活性成分。姜黄素能上调Hsp70［3］，下调Hsp90 客户蛋白如BCL-ABL［4］，NF-κB，AKT，分解Hsp90 辅伴侣p23［5］。虽然姜黄素具有安全低毒广谱的优点，但由于其水溶性差、体内代谢快、活性偏低和靶点过多等缺点影响其成药性［6］。设计合成姜黄素衍生物，提高其选择性、活性和成药性，具有重要的理论和实际意义［7］。

姜黄素结构为分子重复的同生型孪药，4-羟基-3-甲氧基苯基和共扼β-二酮为其活性结构。作者运用拼合原理在Cur 4 位活泼亚甲基(图1 中用虚线圈出)处引入活性药效团4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基，使Cur 原有的共扼β-二酮与烯醇式互变的结构固定为酮式，设计合成了4-(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)姜黄素(C085，见图1)，并于2008年先申报抗癌专利［8］。中山大学卜宪章等随后报道C085 等4-芳亚甲基姜黄素衍生物为NF-κB 抑制剂［9］和乙二醛酶Ⅰ抑制剂［10］，国外印度Avadhesha Surolia 先报道过C085 有抗疟活性［11］，后发现与微管蛋白也有很好的亲合结合［12］。但目前姜黄素衍生物未有Hsp90 抑制活性报道。

本文先微波合成了C085，然后MTT 法考察C085 对多种肿瘤细胞的抑制活性，Western Blot 法研究其对SKBr3 细胞中Hsp90 和客户蛋白Her2、AKT 的影响。分子对接研究C085 与Hsp90 结合模式。

图1 姜黄素和C085 的化学结构与合成路线Fig.1 Chemical structures of curcumin and C085 and the synthetic route of C085

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

姜黄素、香草醛、哌啶和甲醇等溶剂均购自国药集团化学试剂有限公司。细胞株均购自中科院上海细胞库，由福建医科大学新药研究所常规体外细胞传代。Western Blot 中蛋白质浓度测定用Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific，USA)，显影剂为SuperSignal WestPico(Thermo Scientific，USA)。

1.2 仪器

熔点用上海精密仪器厂X-4 型显微熔点仪测定，温度未经校正。核磁数据采用Bruker Avance Ⅲ型核磁共振仪(400 MHz)测定，TMS 为内标。质谱采用Agilent 6410 Triple Quad LC/MS 测定。微波合成使用美国CEM 微波合成仪。美国BIO-RAD 公司全自动酶标仪。

2 实验方法

2.1 4-(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)姜黄素(C085)的合成

10 mL 微波反应管中依次加入姜黄素368 mg(1 mmol)，香草醛304 mg(2 mmol)，无水甲醇3 mL，哌啶30 μL，微波100 ℃下反应30 min，浓缩移去溶剂，残余物上硅胶柱分离纯化，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚=1∶3，得黄色粉末150 mg，收率33%，mp.96～98 ℃。

2.2 MTT 法检测C085 对细胞增殖的抑制作用

选用9 株人肿瘤细胞:人乳腺癌细胞SKBr3、人慢性粒细胞白血病急变细胞株K562、人急性髓系白血病细胞株HL-60、人肝肿瘤细胞株HepG2、小鼠黑色素瘤细胞株B-16、人结肠癌细胞株SW480、人胰腺癌细胞株Bxpc-3、人神经母细胞瘤细胞株SHSY5Y、人胃癌细胞株MGC80-3。将细胞(10000 个/孔)接入96 孔培养板培养过夜，实验组分别加入不同浓度的C085(DMSO 为空白对照)和姜黄素，对照组不加药。另设空白组(只加培养基，无细胞)，每组设三个平行孔，37 ℃培养48 h，加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL/孔，继续培养4 h 后，离心弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡10 min，充分裂解后，用全自动酶标仪(美国BIO-RAD 公司生产)检测570 nm处的吸光度(OD570)值。根据吸光度计算细胞生长抑制率。

以同一药物的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图，可得到剂量反应曲线，根据线性回归方程求出该药物的半数抑制浓度IC50，即细胞存活率减少50%时的药物浓度。

2.3 C085 对Hsp90 客户蛋白的降解作用

用C085(0.5、2.5、10 μM 三个浓度)，Cur(5、25、50 μM 三个浓度)处理人乳腺癌SKBr3 细胞24 h，0.5 μM 的GDA 作为阳性对照，等量的DMSO 作为阴性对照。吸去培养液，收集SKBR3 细胞，PBS漂洗1 次，加入NP-40 细胞裂解液，4 ℃裂解30 min，12000 rpm 离心15 min 取上清，测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度一致，进行SDS-PAGE 电泳。再转膜到PVDF 膜上。一抗室温封闭2 h，TBST 洗涤3次，每次10 min，二抗室温孵育1 h，TBST 洗涤后用显影剂显影观察。

2.4 分子对接模拟C085 与Hsp90 蛋白结合模式

C085 对接入Hsp90α 和NVP-AUY922 的复合物晶体结构(PDB 编码:2VCI)。所有对接操作在SybylX1.3 药物设计软件中的surflex-dock 程序下按默认值完成。

3 实验结果

3.1 C085 结构鉴定数据

黄色粉末;mp.96～98 °C;1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ:7.79 (s，1H)，7.74 (d，J=15.2 Hz，1H)，7.49 (d，J=16.4 Hz，1H)，7.16 (dd，J=8.4，2 Hz，1H)，7.09 (dd，J=8.1，2 Hz，1H)，7.04～7.02(m，3H)，6.99-6.96 (m，2H)，6.95 (d，J=15.4 Hz，1H)，6.91 (d，J=8.2 Hz，1H)，6.88 (d，J=8.2 Hz，1H)，6.86 (d，J=8.3 Hz，1H)，6.79 (d，J=16 Hz，1H)，5.93 (s，1H)，5.92 (s，1H)，5.88(s，1H)，3.92 (s，3H)，3.89 (s，3H)，3.83 (s，3H);13C NMR (CDCl3，100 MHz)δ:198.7，186.9，148.9，148.5，148.1，147.2，146.8，146.8，146.5，145.1，140.9，138.6，127.4，126.7，125.9，125.7，125.3，124.0，123.6，119.9，114.8，114.8，114.8，112.4，110.4，110.0，56.1，56.0，56.0;ESI-MS m/z［M-H］-501.1333。

3.2 C085 抗肿瘤活性测定结果

C085 对人乳腺癌细胞SKBr3、人慢性粒细胞白血病急变细胞株K562、人急性髓系白血病细胞株HL-60、人肝肿瘤细胞株HepG2、小鼠黑色素瘤细胞株B-16、人结肠癌细胞株SW480、人胰腺癌细胞株Bxpc-3、人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y、人胃癌细胞株MGC80-3 的IC50值依次为0.51、1.26、2.90、0.81、1.77、1.31、8.22、1.93、7.41 μmol/L(见表1)。C085 对上述各细胞株都表现出比母体药物Cur 更强的细胞毒作用。特别是对SKBr3 和HepG2分别比姜黄素强36 倍和16 倍。以上结果表明C085 对体外肿瘤细胞增殖抑制作用比其母体药物Cur 的抑制作用明显增强。

表1 C085 和姜黄素抑制肿瘤细胞增殖活性Table 1 Cytotoxicity of C085 and Cur on tumor cell lines

3.3 C085 对Hsp90 客户蛋白的降解作用

不同浓度的C085 处理SKBr3 细胞24 h 后，相关蛋白表达的Western blot 分析结果见图2。图2表明随着C085 浓度的增加，Hsp90 的客户蛋白Her2 和AKT 在24 h 的作用时间下，均呈现明显降解趋势，而Hsp90 的表达量基本不变，即C085 对Hsp90 的客户蛋白有降解抑制作用。这一方式与阳性对照的Hsp90 抑制剂格尔德霉素(GDA，0.5μM)一致。

图2 C085 对Hsp90 客户蛋白的Western blot 分析结果Fig.2 Western blot analyses of SkBr3 cell lysates for Hsp90 client protein degradation.

3.4 分子对接模拟C085 与Hsp90 蛋白结合模式

C085 与Hsp90 蛋白结合模式图见图3。C085和Hsp90α 中的氨基酸残基Ser50、ASN51、LYS58、Asp102、PHE138 形成5 个氢键，并且在ATP 结合口袋中C086(黄色分子)与NVP-AUY922(红色分子)重叠得很好。

图3 C085(黄色分子)对接模式图和与NVP-AUY922(红色分子)重叠Fig.3 A docking model of C085 (yellow)bound to the ATP binding site of human Hsp90α overlapped with NVPAUY922 (red)

4 讨论

本论文通过体外MTT 法，Western bolt 方法和分子对接模拟，首次提出4-(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)姜黄素(C085)很可能是Hsp90 抑制剂。Hsp90 抑制剂可分为N 端抑制剂，C 端抑制剂和影响Hsp90 与辅伴侣结合三类。C085 其具体作用方式还需用免疫共沉淀和FP 等方法进一步研究。

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