S100A11慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

刘德勇，张庆丽，龙晓兰，彭和人，谢海龙(.湖南环境职业技术学院病理教研室，湖南 衡阳 4005； .南华大学肿瘤研究所)

我国是原发性肝癌的高发区，死亡率居恶性肿瘤第二位，复发转移是肝癌死亡的主要原因[1]。目前肝癌的主要治疗方法是分子靶向治疗、化疗栓塞治疗、肝癌规范化治疗等[2-3]。S100钙结合蛋白A11(S100A11)是S100家族的重要成员之一[4]。研究发现S100A11与肿瘤的发生和转移密切相关，在结肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中高表达，尤其是在肝癌中，S100A11高表达能促进肝癌的侵袭和迁移[5-8]。因此，S100A11可作为肝癌潜在的治疗靶点。本研究通过慢病毒感染建立Huh-7 S100A11稳定细胞珠，为肝癌的侵袭和迁移机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

293T细胞购自中国科学院上海生化细胞所；Huh-7细胞购自ATCC细胞库；Huh-7EGFRvIII细胞由本实验室构建保存。3种细胞均用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃ 5%CO2的条件下培养。

1.2 材料和试剂

限制性内切酶、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、Real-Time PCR试剂盒购自TaKaRa公司；dNTP购自Sangon公司；胎牛血清、DMSO、DMEM均购自Gibco公司；6孔板、冻存管、细胞培养皿购自Corning公司。T-PER 组织蛋白裂解液、BCA 蛋白分析试剂盒和Lumi-phosWB发光底物均购自Pierce公司；DNA提纯试剂盒购自Axygen公司；HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG抗体由上海康城公司生产；S100A11抗体购自abcom公司；慢病毒包装质粒pWPT、pAX2、pMD2.G由日内瓦大学T.Didier博士馈赠。所用引物均在上海Invitrogen公司合成。

1.3 慢病毒表达载体质粒构建及鉴定

提取细胞总RNA:Huh-7EGFRvIII细胞于6cm培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中常规培养。待细胞生长至90%左右，PBS洗细胞2次，加入1 mL Trizol，充分吹打后移至1.5 mL EP管中；加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15s，在室温下孵育5 min，12 000 g离心15 min；将上清移至新的EP管中，加入0.5 mL异丙醇，在-20℃条件下孵育20 min，4℃，12,000 g 离心10 min；去上清，加入1 mL 75%乙醇，4℃，7500 g 离心5 min；室温干燥20 min，用DEPC水处理后的H2O溶解，分光光度计定量RNA。

逆转录：提取的细胞总RNA 取1 μL与Oligo dT (10 μmol/L) 1 μL 混合，72 ℃孵育5 min，然后置于冰上5 min；之后加入15 μL反转录混合液(6.1 μL NucLease-free H2O，4 μL 5×RT Buffer，1 μL 10 mmol/L dNTPs，2 2.4 μL 25 mmol/L MgCL，1 μL Improm-ⅡTM Reverse Transcriptase，0.5 μL Rnase RibonucLease Inhibitor)，分别于25 ℃孵育5 min，42 ℃孵育1 h，70 ℃孵育15 min，获得cDNA。

PCR:GenBank查找 S100A11基因序列，设计并合成引物：S100A11-F：5′CGacgcgtgccgc CATGGCAAA AATCTC CAGCC3′；S100A11-R：5′ATAAGAATgcggccgcTCAGGTCCGCTTCTGGG A AG3′。扩增产物为含有S100A11基因完整的序列，长度为348 bp。以cDNA 为模板，反应体系：1 μL 模板，5 μL 10×buffer，5 μL 2 mM/L dNTP，2 μL MgSO4，1 μL KOD-plus酶，引物各1 μL，以 ddH2O 补足50 μL。PCR反应条件：变性94 ℃ 4 min ； 94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，68 ℃ 4 min，30个循环；68 ℃ 10 min； 10 ℃保存，1.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

载体构建：回收PCR产物与pWPT 载体，同时用MluⅠ和NotⅠ酶进行酶切。酶切产物经回收后，用连T4 DNA接酶连接，连接产物转化Top10感受态菌。阳性细菌克隆，命名为pWPT-S100A11，送上海美吉生物医药科技有限公司测序。

1.4 慢病毒载体包装

取6代293T细胞复苏于6 cm培养皿，长满后接种到 10 cm培养皿，常规培养至细胞密度为70%。包装当天早上将培养基换成无血清DMEM，37 ℃孵育2 h。目的基因质粒pWPT-S100A11、pWPT-GFP为对照各20 μg，包装质粒 PAX2 质粒 10 μg，外壳质粒 pMD2.G质粒6 μg，加水补足至 500 μL，逐滴加入2.5 mol/L CaCl250 μL，轻轻混匀，再逐滴加入 500 μL 2× HBS (280 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L Na2HPO4，12 mmol/L Glucose，50 mmol/L HEPES，pH 7.05)，每滴加入后均需充分混匀，然后室温放置 5～20 min。再滴加入 293T 细胞10 cm培养皿中，滴入部分的培养基颜色变浅，滴加完毕后轻柔摇晃混匀。 6～8 h后，将培养基更换为新鲜的DMEM+10%FBS，此时显微镜下可以观察到培养皿底部未长细胞的部分有沙状钙颗粒。 37 ℃培养48 h，荧光显微镜观察pWPT-GFP组感染效率，收集293T细胞培养上清至5 mL离心管中，2 000 rpm离心5 min，用10 mL针筒吸取上清，然后将针头换成0.22 μm滤器，过滤后分装于EPP管中，即为包装得到的慢病毒颗粒悬液，该病毒可直接用于感染或-80 ℃保存。

1.5 慢病毒感染Huh-7细胞

将生长良好的Huh-7细胞铺于6 孔板中，种植数目不宜过多，细胞生长至50%时开始感染。更换培养基，以4 μg/mL的终浓度加入Polybrene，37 ℃富裕30 min后分别加入pWPT-GFP与pWPT-S100A11慢病毒悬液100 μL，继续培养8 h，更换培养基。待细胞生长至90%后传代。48小时后GFP病毒感染的细胞可见荧光，以此初步判断病毒包装及感染是否成功。

1.6 Real-Time PCR检测感染细胞S100A11 mRNA的表达

Huh-7细胞、经上述步骤感染的Huh-7GFP细胞和Huh-7-S100A11细胞培养于6 cm皿中，生长至90%后收集。按照上述方法提取细胞总RNA，并进行逆转录得产物cDNA，将cDNA进行定量。以cDNA为模板进行TR-PCR。引物：S100A11上游引物GAGTCCCTGATTGCTGTCTTCC，S100A11下游引物AGGGTCCTTCTGGTTCTTTGTG。反应体系：1 μL 模板，5 μL 10×buffer，5 μL 2 mmol/L dNTP，2 μL MgSO4，1 μL KOD-pLus酶，引物各1 μL，以ddH2O补足50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 4 min ； 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，30个循环；68 ℃ 10 min； 4 ℃保存。PCR产物用 1.8%琼脂糖凝胶电泳检测。仪器采用ABI PRISM 7900HT。采用比较CT(Cycle threshold)法相对定量。

1.7 Western blotting 检测感染细胞S100A11蛋白的表达

取Huh-7细胞、Huh-7GFP细胞、Huh-7-S100A11细胞种植于6 cm皿中，37 ℃培养生长至90%后，用预冷的PBS缓冲液洗3遍，加入100 μL预冷的蛋白裂解液，收集细胞至1.5 mL EP管中，放在冰上裂解30 min后，12 000 g 4 ℃离心15 min，取上清用BCA试剂盒测定浓度。剩余上清移至另外EP管中并加入SDS loading buffer混匀后，煮沸10 min，置-20 ℃保存。三种蛋白各取20 μg样品蛋白经12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，取PVDF膜与电泳后的凝胶于转膜仪上进行转移40 min。转膜结束后用PBS于振荡器上洗膜10 min，将PVDF膜放入5%脱脂奶粉配置的封闭液中，封闭2 h。S100A11抗体1∶100稀释，GAPDH抗体1∶5 000稀释后加一抗，4 ℃孵育过夜。次日用PBST洗3次，每次15 min。用HRP标记的羊抗鼠抗体1∶1 000稀释后，孵育2 h。用PBS洗3次，每次10 min后，加显影剂显影。

2 结 果

2.1 慢病毒表达载体质粒构建及鉴定

PCR扩增得到S100A11基因片段，长度为348 bp(图1A)。将S100A11基因片段经MluⅠ和NotⅠ酶切后，克隆入pWPT载体，酶切鉴定(图1B)，阳性克隆送Invitrogen公司测序。测序结果经对比与GenBank中标准一致(图1C)。

图1 慢病毒表达载体构建

2.2 慢病毒载体包装

pWPT-S100A11、pWPT-GFP慢病毒表达载体包装于293T细胞，37 ℃培养48 h后，荧光显微镜观察可见绿色荧光(图2)，说明病毒包装成功。

图2 包装48 h后荧光图(×100)

2.3 慢病毒感染Huh-7细胞

pWPT-S100A11与pWPT-GFP慢病毒感染Huh-7细胞培养48 h后GFP病毒感染的细胞可见荧光，由此可以判断病毒感染成功。

图3 pWPT-GFP慢病毒感染Huh-7细胞荧光图(×400)

2.4 Real-Time PCR检测感染细胞S100A11 mRNA的表达

pWPT-S100A11与pWPT-GFP慢病毒感染Huh-7细胞后，通过Real-Time PCR检测Huh-7、Huh-7GFP、Huh7-S100A11三总细胞中S100A11mRNA的表达情况，结果显示Huh7-S100A11中S100A11mRNA表达量最高，Huh7-S100A11细胞中S100A11的表达量明显高于其它两组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.5 Western blotting 检测感染细胞S100A11蛋白的表达

通过Western blotting检测Huh7、Huh7-GFP、Huh7-S100A11三种细胞中S100A11蛋白的表达，结果显示Huh7-S100A11中S100A11的表达量明显高于其他两种细胞(图4)。

图4 不同细胞中S100A11蛋白的表达

3 讨 论

目前研究认为，S100A11参与多种生物学过程的调节，例如，调节酶的活性、细胞的生长和凋亡、炎症反应等[9]。编码S100A11的基因位于1号染色体q21区，该区易发生重排，引起肿瘤的发生和转移。S100A11对肿瘤细胞具有双向调节的作用，在食管癌、膀胱癌中低表达，在大肠癌、胰腺癌、淋巴瘤中高表达。S100A11在肺鳞癌和肺腺癌中高表达，在小细胞肺癌中低表达。S100A11也可以作为肿瘤抑制因子，抑制P21的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长增值[10]。S100A11在对肿瘤细胞具有双向调节作用，在肿瘤的诊断和防治上具有一定的意义。研究发现S100A11的表达升高，可以促进肝癌细胞的侵袭迁移。

慢病毒载体(lentiviral vectors,LV) 包含了包装、感染、稳定整合所需要的遗传信息，是新发展起来的基因载体。利用表达载体和包装质粒同时共感染细胞可以产生高滴度的病毒颗粒，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，慢病毒载体可以将携带的目的基因整合到宿主的基因组中，从而高水平的表达效应分子[11]。慢病毒载体可感染分裂细胞和非分裂细胞、 转移基因片段容量较大、 目的基因表达时间长、 不易诱发宿主免疫反应等优点[12]。

本研究采用基重组技术，构建重组慢病毒载体pWPT-S100A11，感染Huh7-细胞，获得稳定Huh7 S100A11细胞，并鉴定S100A11表达量升高，为进一步研究S100A11基因在肝癌侵袭迁移中的作用机制奠定了一定的实验室基础。

[1]Shin JW,Chung YH.Molecular targeted therapy for hepatocellular carcinoma:current and future[J].World J Gastroenterol,2013,19(37):6144-6155.

[2]Kim HY,Park JW.Clinical trials of combined molecular targeted therapy and locoregional therapy inHepatocellular carcinoma:past,present,and future[J].Liver Cancer,2014,3(1):9-17.

[3]Bruix J,Gores GJ,Mazzaferro V.Hepatocellular carcinoma:clinical frontiers and perspectives[J].Gut,2014,63(5):844-855.

[4]Sakaguchi M,Huh NH.S100A11,a dual growth regulator of epidermal keratinocytes[J].Amino Acids,2011,41(4):797-807.

[5]Melle C,Ernst G,Schimmel B,et al.Different expression of calgizzarin (S100A11) in normal colonic epithelium,adenoma and colorectal carcinoma[J].Int J Oncol,2006,28(1):195-200.

[6]Ohuchida K,Mizumoto K,Ohhashi S,et al.S100A11,a putative tumor suppressor gene,is overexpressed in pancreatic carcinogenesis[J].Clin Cancer Res,2006,12(18):5417-5422.

[7]Xiao MB,Jiang F,Ni WK,et al.High expression of S100A11 in pancreatic adenocarcinoma is an unfavorable prognostic marker[J].Med Oncol,2012,29(3):1886-1891.

[8]Luo X,Xie H,Long X,et al.EGFRvIII mediates hepatocellular carcinoma cell invasion by promoting S100 calcium binding protein A11 expression[J].PLoS One,2013,20,8(12):1-9

[9]Gross SR,Sin CG,Barraclough R,et al.Joining S100 proteins and migration:for better or for worse,in sickness and in health[J].Cell Mol Life Sci,2014,71(9):1551-1579.

[10]Salama I,Malone PS,Mihaimeed F,et al.A review of the S100 proteins in cancer[J].Eur J Surg Oncol,2008,34(4):357-364.

[11]方芳,朱平.慢病毒载体的改进为基因治疗带来了新的希望[J].中国实验血液学杂志,2013,21(5):1336-1339.

[12]Segura MM,Mangion M,Gaillet B,et al.New developments in lentiviral vector design,production and purification[J].Expert Opin Biol Ther,2013,13(7):987-1011.