食管胃交界腺癌和远端胃癌KLF4 SP1及Cyclin D1表达的对比研究*

崔晋峰 赵晨燕 曹立勇 吴文新 李月红 王 媛 薛丽英 张祥宏

胃癌是最常见的恶性肿瘤。国内学术界一般认为胃窦是胃癌的最常见的发生部位，贲门次之。但是过去的几十年中，欧美国家的消化道恶性肿瘤类型和发生部位发生了明显的变化：一是组织学类型上，食管鳞状细胞癌的发生率下降而食管腺癌的发生率上升；二是从肿瘤发生部位上，胃远端（胃窦部）胃癌发生率下降，而食管胃交界腺癌的发生率出现惊人的上升趋势［1］，有关食管胃交界腺癌（adenocarcinoma of the esphagogastric juntion，AEG）的问题引起了国外学者的广泛关注。目前，越来越多的研究显示贲门腺癌与远端胃癌（distal gastric cancer，DGC）明显不同，但却与食管远端腺癌有许多相似之处，因此，学术界都倾向将食管胃交界腺癌列为一独立类型的肿瘤。

本研究前期对河北省胃癌高发区（赞皇县）和食管癌高发区（磁县）两个地区居民近十四年4 334例胃癌的发病情况进行了系统性回顾分析，发现贲门癌在胃癌中所占的比例呈逐年增高的趋势［2］，但其发生机制尚不清楚。我们前期初步发现CK，MUC等分子以及p14ARF-Mdm2-p53信号通路在贲门腺癌和远端胃腺癌中的表达有着明显的差异，这一发现提示贲门腺癌与远端胃腺癌可能在细胞增殖和分化过程中存在一定的差异［3-4］。

SP1（specificity protein 1）/Krüppel样转录因子（Krüppel like factor，KLF）家族，是一组锌指蛋白，在细胞生长、分化及凋亡过程中发挥重要作用［5］。KLF4是KLF家族成员之一，能够通过竞争性结合SP1的GC结合位点而抑制其下游基因的表达。研究认为KLF4和SP1的异常表达与与肿瘤的发生密切相关。细胞周期素D1（Cyclin D1）是一种原癌基因，被认为是SP1的下游目的基因之一［6］。目前，有关KLF4，SP1和Cyclin D1在食管胃交界腺癌及远端胃癌中表达情况的对比研究鲜见报道。因此，本研究选取食管胃交界腺癌和远端胃癌病例，利用免疫组织化学的方法检测KLF4、SP1和Cyclin D1的表达情况及其相互之间的关系，以期揭示食管胃交界腺癌与远端胃癌生物学行为的差异，为胃癌的合理防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例资料 选取2004年2月至2006年3月河北医科大学第二医院病理科和磁县县医院病理科存档蜡块，所有病理资料完整。对全部病例的所有蜡块重新切片，行HE染色，由两位高年资深病理医师进行复查。诊断标准：依据WHO（2000年）提出的标准，将瘤体穿过食管胃鳞柱交界处的腺癌定义为食管胃交界腺癌，按照Siewert分型本组病例均为Ⅱ型。

按照肿瘤发生部位本组包括食管胃交界腺癌58例，其中高中分化腺癌24例，低分化腺癌及黏液腺癌、印戒细胞癌34例。远端胃癌47例，其中高中分化腺癌30例，低分化腺癌及黏液腺癌、印戒细胞癌17例。

1.1.2 实验试剂 兔抗KLF4多克隆抗体购自美国Chemicon公司，鼠抗SP1单克隆抗体购自美国Santa公司，兔抗Cyclin D1多克隆抗体购自美国Neomarkers公司，免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 取经甲醛固定，石蜡包埋的蜡块，5 μm；连续切片，60℃烤片1 h后经二甲苯连续脱蜡3次，梯度乙醇水化，然后采用免疫组织化学SP法，染色步骤严格按试剂盒要求进行，采用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 免疫组织化学结果判定 KLF4蛋白阳性表达主要定位于胞浆，细胞核也可有少量着色；SP1阳性表达定位于细胞核；Cyclin D1蛋白阳性表达定位于细胞核和/或胞浆。以蛋白表达定位区出现棕黄色颗粒或团块为染色阳性，全面观察切片后，随机选取10个高倍镜视野计数阳性细胞百分比的平均数，≤10%计为（-），＞10%计为（+）。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计学软件，数据采用χ2检验、Fisher确切概率计算法及Spearman相关分析进行统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KLF4在食管胃交界腺癌和远端胃癌中的表达情况

KLF4阳性反应定位于胞浆，细胞核中有少量表达。在食管胃交界腺癌及远端胃癌组织的胞浆和/或细胞核中可见棕黄色颗粒或团块的阳性表达（图1A，D）。

免疫组织化学结果显示，KLF4在食管胃交界腺癌中的阳性表达率明显高于远端胃癌（70%vs.42.6%，P＜0.05，表1）。对食管胃交界腺癌与远端胃癌之间相同分化程度中KLF4的表达进行比较，发现在高中分化食管胃交界腺癌中KLF4的阳性表达率高于高中分化远端胃癌（P＜0.05）；而且在低分化组中这种差异同样存在（表2）。结果提示KLF4作为一种肿瘤抑制因子，其在远端胃癌的发生中发挥更重要的作用。

2.2 SP1在食管胃交界腺癌和远端胃癌中的表达情况

SP1阳性反应定位于细胞核。在食管胃交界腺癌及远端胃癌组织的细胞核中可见棕黄色颗粒或团块的阳性表达（图1B，E）。

免疫组织化学结果显示SP1在食管胃交界腺癌中的阳性表达率明显低于远端胃癌（40.0%vs.68.1%，P＜0.05，表1）。另外，结果还显示，SP1在食管胃交界腺癌高中分化组中的阳性表达率明显低于远端胃癌高中分化组（P＜0.05，表2）；但在低分化组中的阳性表达率两个部位胃癌之间未见明显差异。结果提示SP1的高表达可能与远端胃癌的发生有关。

2.3 Cyclin D1在食管胃交界腺癌和远端胃癌中的表达情况

Cyclin D1阳性反应定位于细胞核和/或胞浆。在食管胃交界腺癌及远端胃癌组织的细胞核和/或胞浆中可见棕黄色颗粒或团块的阳性表达（图1C，F）。

免疫组织化学结果显示Cyclin D1在食管胃交界腺癌中的阳性表达率与远端胃癌相比未见明显差异（表1）。同时，在食管胃交界腺癌和远端胃癌的高中分化和低分化组之间Cyclin D1的表达也未见明显差异（表2）。

2.4 食管胃交界腺癌和远端胃癌中KLF4、SP1和Cyclin D1与淋巴结转移的关系

在58例食管胃交界腺癌组中KLF4和SP1的表达与淋巴结转移均无关（P＞0.05）。而Cyclin D1在无淋巴结转移组中的表达率低于发生淋巴结转移组（22.7%vs.58.3%，P＜0.05，表3）。

在47例远端胃癌组中KLF4在未发生淋巴结转移组中的表达率明显高于在发生淋巴结转移组（63.2%vs.28.6%，P＜0.05）。SP1在无淋巴结转移组中的表达率低于在发生淋巴结转移组（47.4%vs.82.1%，P＜0.05）。Cyclin D1在未发生淋巴结转移组中的表达率低于发生淋巴结转移组（26.3%vs.57.1%，P＜0.05，表3）。

2.5 食管胃交界腺癌和远端胃癌中KLF4、SP1和Cyclin D1蛋白表达的相互关系

在食管胃交界腺癌中KLF4与SP1和Cyclin D1之间未见明显相关关系。在远端胃癌中KLF4与SP1（r=-0.334，P=0.022）及 KLF4 与 Cyclin D1（r=-0.341，P=0.019）呈负相关；SP1与Cyclin D1呈正相关（r=0.340，P=0.019）。

图1 KLF4、SP1和Cyclin D1在食管胃交界腺癌和远端胃癌中的阳性表达情况 （SP×400）Figure1 Positive staining of KLF4，SP1，and Cyclin D1 in adenocarcinoma of the esophagogastric junction and distal stomach（SP×400）

表1 KLF4、SP1和Cyclin D1在食管胃交界腺癌和远端胃癌中的表达Table1 Expression of KLF4，SP1，and Cyclin D1 in adenocarcinoma of the esophagogastric junction and distal stomach

表2 KLF4、SP1和Cyclin D1在高中分化和低分化腺癌中的表达情况Table2 Expression of KLF4，SP1，and Cyclin D1 in well-or moderately differentiated cases and poorly differentiated cases

表3 食管胃交界腺癌和远端胃癌中KLF4、SP1和Cyclin D1与淋巴结转移的关系Table3 The relationship of KLF4，SP1，and Cyclin D1 expression with lymph node metastasis in adenocarcinoma of the esophagogastric junction and distal stomach

3 讨论

近年来，有关胃癌发生部位变化及其可能机制的研究已经成为胃癌研究的热点领域。近期研究提示胃食管交界腺癌可能是胃癌的一种特殊类型，其在危险因素、肿瘤特征及生物学行为方面与远端胃癌存在一定差异。Cho等［7］对比分析了一组韩国贲门腺癌和非贲门腺癌患者肥胖发生情况，发现肥胖更多见于贲门腺癌患者，体重指数BMI是贲门腺癌独立危险因素。Yang等［8］从细胞信号转导通路角度研究了贲门腺癌的发生机制，发现mTOR/4E-BP1通过激活mTOR参与了贲门腺癌发生。Xu等［9］对比研究了贲门腺癌和远端胃癌遗传改变的发生情况，结果提示从总的杂合性丢失率上两个部位肿瘤无明显差异，但丢失类型上两组有显著不同。因此探讨贲门腺癌和远端胃癌发生机制的差异可以为胃癌的合理防治提供科学依据。

KLF4是KLF因子家族成员之一，存在于胃肠道和上皮组织中，在细胞分化和细胞周期调控中扮演作用角色。研究发现在特定的细胞微环境下，KLF4既可以作为肿瘤抑制因子又可以作为癌基因。Li等［10］研究发现KLF4的表达缺失可以促进皮肤癌的发生；Patel等［11］研究认为KLF4作为肿瘤抑制因子参与了结肠癌的发生；而Pandya等［12］则发现KLF4的高表达和乳腺癌的分化程度以及转移有关。目前越来越多的研究认为KLF4在胃肠道是作为一个肿瘤抑制因子［13］。在本研究中发现KLF4在远端胃癌中的表达明显低于食管胃交界腺癌，而且随着分化程度的降低KLF4的表达也逐渐减少。结果提示食管胃交界腺癌发生的分子机制有别于远端胃癌，KLF4的表达降低与远端胃癌的发生关系更为密切。

SP1和KLF4同属于SP1/KLF4家族，都是具有锌指结构的转录因子。SP1可以通过调控富含GC序列启动子的基因表达，进而参与调控癌基因、抑癌基因以及细胞周期、凋亡等相关分子。SP1在胃癌、胰腺癌、乳腺癌和及甲状腺肿瘤细胞中高表达；抑制SP1的活性可以明显抑制肿瘤的生长。目前SP1被认为是一个促癌蛋白前SPI被认为是一个促癌蛋白［14］。本研究发现SP1在远端胃癌中的表达明显高于食管胃交界腺癌；而且这一差异在高中分化组中更加明显。这一结果进一步证实食管胃交界腺癌与远端胃癌的发生机制是不同的，而SP1则与远端胃癌的发生关系更为密切。

细胞周期素D1（Cyclin D1）是一种原癌基因，可以与CDK4结合，磷酸化Rb，进而启动S期相关基因的转录，使细胞由G1期进入S期。Cyclin D1表达失控时将引起细胞增殖周期失调，细胞失控性生长形成肿瘤。本研究发现在食管胃交界腺癌和远端胃癌中Cyclin D1的表达无明显差异。提示Cyclin D1并不是食管胃交界腺癌和远端胃癌发生机制差异性的关键分子。

KLF4和SP1在C-端的三个锌指基因结构具有高度同源性，KLF4能够通过竞争性结合SP1的GC盒结合位点而抑制下游基因的表达。如果KLF4和SP1之间的平衡被打乱，细胞会发生癌变。Kanai等［15］研究发现KLF4的表达缺失和SP1的过表达参与了胃癌的发生。目前Cyclin D1被认为是KLF4的下游目的基因之一，KLF4对Cyclin D1基因的转录抑制作用部分是通过与Cyclin D1启动子的SP1结合区域相互作用介导的。Shie等［16］发现在结直肠癌中SP1过表达能使KLF4对Cyclin D1启动子活性的抑制作用完全消失，从而影响细胞的增殖、分化和凋亡。本研究发现在发生淋巴结转移的食管胃交界腺癌中Cyclin D1蛋白的表达比未发生淋巴结转移的表达明显增多；但是KLF4与SP1和Cyclin D1之间未见明显相关关系。提示Cyclin D1可能参与了食管胃交界腺癌的转移，但可能并非由KLF4与SP1介导的。而在远端胃癌中KLF4蛋白在发生淋巴结转移中的表达比未发生淋巴结转移中的表达明显减少；SP1蛋白在发生淋巴结转移的患者癌组织中比未发生淋巴结转移患者癌组织中表达增多；Cyclin D1蛋白在发生淋巴结转移的患者癌组织中比未发生淋巴结转移患者癌组织中表达增多。而且在远端胃癌中KLF4与SP1和Cy-clin D1之间均呈负相关，这与Wei等［17］的研究结果一致。以上结果提示KLF4、SP1和Cyclin D1可能共同参与了远端胃癌的发生发展，其机制可能为KLF4和SP1的表达异常共同影响了其下游基因Cyclin D1的蛋白表达，进而导致细胞发生恶性转化和转移。

综合以上研究结果，本研究认为食管胃交界腺癌可以作为是一种独立的类型，其发生机制有别于远端胃癌。

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