MDM2在胃癌组织中的表达及与Hp－L型感染关系的研究

柯桥利 台令华 于东红

（蚌埠医学院第一附属医院病理科；蚌埠医学院病理学教研室 安徽233004）

胃癌的发生发展过程是一个多基因、多步骤共同作用的结果。其中癌基因的激活和抑癌基因的失活起着极其重要的作用。MDM2是一种癌基因，与P53和Rb结合后使其失去活性，从而调节细胞周期和凋亡［1，2］。已知幽门螺杆菌（Helicobacterpylo－ri，Hp）与慢性胃炎、胃癌等疾病的发生密切相关，1994年被世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）列为第一类致癌因子［3］。幽门螺杆菌L型（Hp－L）是Hp的细胞壁缺陷型，常在不利于Hp生长的环境下形成［4］。因大多数呈球形，故又称为幽门螺杆菌球形体。已知Hp－L型的生物学性状和致病性与原菌有相似之处，也有明显不同，且与胃癌的发生有一定关系［5］。目前国内外有关MDM2蛋白在胃癌组织中表达意义的研究比较少，而MDM2蛋白与Hp－L型感染在胃癌中的关系则罕见报道。因此我们采用免疫组化、革兰染色和RT－PCR方法检测胃癌组织中MDM2的表达及Hp－L型感染的情况，旨在探讨胃癌组织中MDM2表达的意义及与Hp－L型感染的关系。

材料和方法

1.材料

1.1 收集蚌埠医学院第一附属医院病理科2010年6月至2011年6月间经手术切除胃腺癌石蜡包埋组织块100例，并随机抽取40例对应切缘正常组织作为对照组，术前未经任何抗癌治疗。其中，男68例，女32例；年龄31－83岁，中位年龄57岁。所有标本经10% 甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片，做HE染色、革兰染色及免疫组织化学染色。由2名病理主治医师复查HE染色切片，病理诊断依据第4版WHO胃癌组织学分类标准。其中，高、中分化42例，低分化58例；有淋巴结转移65例，无淋巴结转移35例；癌组织未浸润至浆膜层22例，浸润至浆膜层78例。按照国际抗癌联盟（UICC）公布的TNM分期标准（2002年，第6版）进行分期：Ⅰ－Ⅱ期69例，Ⅲ－Ⅳ期31例。

1.2 收集2013年2月至2013年6月蚌埠医学院第一附属医院胃癌手术的新鲜标本30例及远端正常组织（距肿瘤边缘组织约5 cm处）作为对照组。所有标本术前未行放、化疗及免疫治疗，并均在离体30 min内切取。

2.方法及判断标准

2.1 Hp－L型的测定

1）组织切片经革兰染色油镜（10×100）下观察并计数，每例组织随机抽取10－15个视野，取平均数Hp－L和Hp平均数≥20个为阳性，＜20个或未查见Hp和Hp－L型为阴性。Hp－L型呈多种形态，有圆球体、短杆状、丝状等，且大小不等。革兰染色阴性呈红色，阳性呈紫红色，Hp－L型大多数呈革兰染色阴性（即红色），少数Hp－L型革兰染色阳性（紫红色）。而Hp呈海鸥形、螺旋形或是“S”形。Hp－L型可在胃癌癌巢和癌旁组织中聚集成堆，在癌巢坏死处几乎无Hp－L型，正常组织中也少见。在L型阳性的切片上可见到其附着在癌细胞及胃黏膜上皮表面，也可见其存在癌细胞内。2）免疫组化采用Elivision法，试剂为兔抗人Hp－L型抗体（蚌埠医学院微生物学教研室制备），工作浓度为1∶100，同时使用PBS代替一抗作阴性对照组。阳性标准：胃癌细胞、正常胃黏膜上皮细胞胞质及间质巨噬细胞的胞质或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。革兰染色L型细菌检出和免疫组化Hp－L型抗原表达同时阳性者定为Hp－L型感染阳性。

2.2 MDM2的检测

1）MDM2鼠抗人单克隆抗体购于北京中杉金桥公司，为即用型试剂，采用免疫组化SP法，严格按照说明书操作，用PBS代替一抗作阴性组对照。具体判断标准：应用半定量积分法，根据阳性细胞着色强度及范围进行评价。MDM2蛋白的阳性位于细胞核和细胞质出现棕黄色颗粒，以细胞核为主。每张切片随机抽取5个高倍镜（×400）视野观察，计数200个肿瘤细胞，计算阳性细胞所占肿瘤细胞的百分比，取平均值。阴性：不着色；弱阳性：淡棕黄色或是阳性细胞所占肿瘤细胞百分比＜50%；强阳性阳性细胞＞50%或者细胞呈棕黄色。2）逆转录RTPCR法测MDM2在胃癌中的表达，总RNA提取：取50－100 mg胃腺癌组织匀浆后用Trizol提取液提取总RNA，取部分总RNA用紫外分光光度仪A260／A280，要求全部样本 OD260／OD280比值在1.8－2.0之间。cDNA制备：操作过程严格按照逆转录试剂盒说明书进行，PCR扩增：上游引物5′GCCATTGAACCTTGTGTGATTT－3′，下游引物 5′－GCAGGGCTTATTCCTTTTCTTT－3′；β－actin上游引物5－AGCGAGCATCCCCCAAAGTT－3，下游引物5′－GGGCACGAAGGCTCATCATT－3′；反应条件：95℃预变性5 min后，以94℃45 s变性，MDM2退火温度59.1℃，β－actin退火温度55.7℃，各进行45 s，72℃延伸45 s，反应35循环，最后一轮延伸7 min。PCR产物判定：取5μl扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳（电压按100 V，电流60 m A），溴化乙锭显色，结果在GIS凝胶图像处理系统中拍摄记录，并使用Tanon GIS－3500图像分析软件行灰度扫描作半定量分析，以 MDM2的吸光度值与β－actin吸光度值的比作为MDM2的基因表达半定量值。

3.统计学方法

使用SPASS17统计学软件对数据进行χ2检验和t检验，应用Spearman等级相关进行相关性分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.胃癌中型的检测，100例胃癌组织中有79例革兰染色检出L型，其检出率阳性率为79.0%；免疫组化Hp－L型抗原表达阳性的有76例，其阳性率为76.0%，与革兰染色Hp－L型检出阳性率一致（P＞0.05），两组同时出现阳性的有70例，阳性率为70%（即革兰染色L型检出阳性和免疫组化Hp－L型抗原表达同时阳性，Hp－L型阳性，见图1，2），明显高于对照组的32.5%（P＜0.01，见表1）。

表1 不同组织中Hp－L检测情况Table 1 The result of Hp－L detected in different gastric tissues

2.MDM2在胃癌组织中的表达

MDM2在胃癌组织中表达阳性率为71.0%（71／100），显著高于癌旁对照组42.5%（17／40）两者比较有统计学意义（P＜0.05，见表2），经χ2检验，胃癌组织中MDM2的表达与患者的年龄、性别、肿瘤细胞分化程度无关，而与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移和临床分期相关（均P＜0.05，表2，3；见图3）

表2 不同组织中MDM2蛋白的表达情况Table 2 The expression of MDM2 in different gastric tissues

表3 胃癌组织MDM2蛋白表达与临床病理因素的关系Table 3 Relationship between the expression of MDM2 and clinical pathological characteristics in gastric carcinom

3.MDM2扩增产物与内参电泳结果

胃癌组织和对照组胃黏膜总RNA提取后，MDM2基因 PCR 产物为126 bp，humanβ－actin基因产物为285 bp，在胃癌组织和正常胃黏膜中MDM2 mRNA相对表达量分别为2.432±0.214和0.385±0.132，胃癌组织中MDM2表达明显高于癌旁正常胃黏膜组，差异具有统计学意义（P＜0.01，见表4，图4）

表4 不同新鲜胃组织中MDM2蛋白的表达情况Table 4 The expression of MDM2 in different fresh gastric tissues

4.胃癌中Hp－L型感染与MDM2蛋白表达的关系

从表5可见，胃癌Hp－L型阳性组的MDM2表达明显高于其Hp－L型阴性组，应用Spearman秩相关检验，两者之间呈正相关（r＝0.447，P＜0.05）。

表5 胃癌组织中MDM2表达与Hp－L型感染的相关性的分析Table 5 The relativity between expression of MDM2 and the Helicobacter pylori L－form infection

讨 论

MDM2（murine double mimutes）是一种原癌基因，该基因在进化过程中比较保守。MDM2蛋白存在细胞核中，通过与P53结合抑制其转录，MDM2蛋白还能与Rb结合，作用于靶DNA序列，从而促进细胞增殖。研究发现MDM2蛋白有发挥作用的四个结构域：1）N端残基是P53主要结合区域［6］；2）靠近N端是几个著名 MDM2抑制剂结合的区域；3）中间还有个可与多种调节基因结合锌指结构［7］；4）C端与E3泛素连接酶结合位点。研究发现，在多种细胞应激下，如在药物、物理辐射、化学因素等多种作用情况下能够激活P53，细胞内的P53水平升高可以激活与其同一条染色体的MDM2基因进行转录，MDM2表达升高。激活状态下的P53基因对细胞周期进行调控的同时又被高表达的MDM2所抑制，从而形成自动调节的负反馈调节环，调控着细胞的增殖与凋亡［8］。过表达MDM2可以引起细胞无限增殖，甚至恶变。有研究发现在人类多种肿瘤中该基因发生基因扩增、突变及表达异常，如胃癌、肝癌、食管癌等［9－11］。Sugano等［12］应用实时定量RT－PCR联合FISH方法检测结直肠癌中MDM2基因扩增，发现MDM2与肿瘤的临床分期有一定的相关性。王晓玫等［13］通过免疫组织化学方法检测了72例结直肠癌标本MDM2蛋白表达，显示结直肠癌组织MDM2阳性表达与肿瘤侵袭、淋巴结转移密切相关，且伴淋巴结转移、血管侵袭的结直肠癌患者MDM2蛋白表达阳性率相对较高。于雁等［14］通过免疫组化方法检测了93例大肠癌组织MDM2蛋白表达水平，结果显示MDM2蛋白高表达者生存期相对较短。Shimada等［15］研究发现MDM2过表达的食管鳞癌预后差。刘远廷等［16］认为胃癌中MDM2蛋白的表达阳性率明显高于不典型增生等癌前病变组织，MDM2的表达与胃癌的分化程度、浸润深度及淋巴结转移有关。本实验发现本研究采用免疫组化法检测了100例胃癌组及40例对照组的MDM2蛋白表达情况，应用RTPCR检测30例新鲜胃癌组及30例对照组的MDM2 m RNA表达，发现MDM2在胃癌组中表达明显高于癌旁正常胃黏膜组织，本实验还发现MDM2蛋白表达阳性率在侵犯浆膜组高于未侵犯浆膜组；淋巴结转移组的阳性率高于淋巴结未转移组（P＜0.05），提示MDM2表达阳性的肿瘤可能具有更强的浸润和转移能力。

幽门螺杆菌已被证实为某些胃病的原因之一，如活动性胃炎、胃溃疡，同时，幽门螺杆菌也可能是胃癌的发病因素之一［17］。Hp在不利于其生长的环境下为保护自身而发生细胞壁缺陷而形成Hp－L型，即是Hp适应外界不良条件的一种自我保护的形式，具有更大的潜伏性和危险性。其在消化性疾病中的作用已受到越来越多的关注［18］。Figueroa等［19］报胃癌组织中Hp－L型的检出率高于溃疡胃组织中的检出率，提示Hp－L型的长期存在可能与胃癌的发生有关。陈豪等［20］研究发现低浓度的Hp－L与原菌比较更易促进细胞增殖，引起胃癌。Kodama M［21］运用免疫组织化学方法研究发现幽门螺杆菌感染的胃粘膜上皮细胞MDM2蛋白的表达水平高于幽门螺杆菌阴性的胃粘膜上皮细胞，提示幽门螺杆菌感染能够诱导MDM2蛋白的表达。实验研究结果与上述研究有相似之处，显示胃癌组中Hp－L型阳性组中MDM2的表达阳性率高于Hp－L型阴性组，且两者呈正相关（r＝0.447，P＜0.05），提示Hp－L型可能上调MDM2的表达从而抑制细胞凋亡而促进肿瘤生长，故Hp－L型感染可能与胃癌的浸润、转移有关，具体机制有待于进一步研究。

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图 版 说 明

图1 Hp－L型呈圆球状，巨形体、和原生小体等（革兰氏染色×1000，）A：巨形体（粗箭头）和圆球形（细箭头）；B：Hp－L型散在分布癌巢中（细箭头）

图2 Hp－L型在胃腺癌中的阳性表达（A，Elivision×100；B，Elivision×400）

图3 MDM2蛋白在胃腺癌中的表达阳性（A，SP法×100；B，SP法×400）

图4 MDM2m RNA的琼脂糖电泳图（1、3、5为胃癌组，2、4、6为对照组）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Hp－L form cylindrical and spherical，the sphere，giant body and native body（Gram stain×1000Big coccoid Hp－L（thick arrow）and coccoid Hp－L（thin arrow）；B：Hp－L was in gastric cancer nest（thin arrow）

Fig.2 negative expression of Helicobacter pylori L－form in gastric adenocarcinoma（A，Elivision×100；B，Elivision×400）

Fig.3 Positive expression of MDM2 in adenocarcinoma cancerous tissue（A，SP×100；B，SP×400）

Fig.4 Agarose electrophoresis of MDM2mRNA （1、3、5for the gastric cancer group，2、4、6 for the controls group）