线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的研究及体会

张亚敏 徐 虹 孙 华 陈素辉 王富明

缺血性脑血管疾病的高发生率、高致残率严重威胁人类生命健康，建立稳定性强、可重复性高的缺血性脑卒中动物模型是研究急性脑缺血后脑组织损伤的生理病理变化的基础。Longa等［1］以改良线栓法制备了大鼠中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，随后该模型便被广泛应用于脑梗死的研究［2，3］。但MCAO模型制作过程中，易受到多种因素的影响，各个实验室的条件不一，导致脑缺血面积的不稳定及大鼠高死亡率等问题，无法保障后续实验的顺利进行［4］。本课题组通过固定线栓，控制大鼠体重，以改良的Longa法制作MCAO模型，2h后拔出线栓再灌注，并总结了特定型号的栓线适合的大鼠体重范围。

材料与方法

1．实验动物及实验用品:(1)实验动物:SPF级健康雄性SD大鼠，体重230～270g，北京协和医院实验动物中心提供。实验动物许可证号:SCXK(京)2012－0001。(2)饲养条件:室温25 ±1℃，5 只/笼，光照∶黑暗 =12h∶12h，湿度 75%，大鼠术前自由饮水和摄食。(3)实验用品:水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司);2，3，5－氯化三苯基四氮唑(2，3，5－Triphenyltetrazolium chloride，TTC，Sigma，美国);自制大鼠固定板;尼龙线栓(2636－4A，北京沙东生物技术有限公司)，大鼠脑槽(中科院药植所);隔水式恒温培养箱(GHP－9160，上海一恒科技有限公司)。

2．分组与模型制作方法:采用数字表法将动物随机分为两组，组1体重控制为230～249g;组2体重控制为250～269g，每组10只。MCAO模型制作在北京协和医院SPF级实验动物操作中心完成，参考Longa等［1］的线栓法。术前大鼠禁食12h，腹腔注射10%的水合氯醛(0．35ml/100g)麻醉后固定。常规消毒手术视野区皮肤，切开颈部正中皮肤约2～3cm，钝性分离颈部肌肉和结缔组织，从胸锁乳突肌和颈前肌群之间向深部分离，显露右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)，充分暴露右侧颈总动脉、颈内动脉(internal carotid artery，ICA)和颈外动脉(external carotid artery，ECA)。5－0 号手术线结扎ECA根部和CCA分叉处1cm处，CCA挂线但不结扎，ECA距离CCA分叉处约5mm处剪口，使线栓由小口经ECA进入CCA，剪断ECA，线栓进入约5mm时调整栓线方向和弧度，避开翼腭动脉(pterygopalatine artery，PA)的开口处，使栓线沿ICA缓慢插入，遇一定阻力后停止进栓，以使线栓完全闭阻右侧大脑中动脉入口，线栓插入长度约为18．0±0.5mm。双线结扎CCA剪口上方丝线，外留长约1cm左右的线栓后缝合，将大鼠置于笼内。脑缺血2h后拔出线栓实现再灌注，再灌注前以10%的水合氯醛(0．25ml/100g)腹腔注射麻醉动物(减少麻药用量，防止动物因麻药过量死亡)，缓慢地拉出线栓，当看到栓线的黑色标记后剪掉栓线。大鼠清醒后自由接触食物和水。

3．神经功能评分:缺血2h大鼠清醒后参照Bederson等［5］的5级分类法对大鼠神经功能进行盲评:0级:无明显神经功能缺损症状;1级:提尾，左前肢屈曲，不能完全伸展;2级:提尾，左前肢屈曲，置于地面向左侧推动，爬行阻力较右侧下降;3级:在2级基础上爬行时不自主向左侧转圈;4级:意识不清，包括24h内死亡。

4．脑梗死体积测定:两组大鼠MCAO术后24h，腹腔注射10%水合氯醛(0．35ml/100g)深度麻醉大鼠，快速于冰上断头取脑置于平皿中，－20℃速冻10min，待其变硬后取出置于脑槽中，去除额级，冠状位切成2mm厚的脑片，取前6块放入0.1%TTC溶液中避光37℃孵育30min，每5min翻动1次使其均匀着色，正常组织染为红色，脑梗死区不着色(苍白色)。4%多聚甲醛固定1h后拍照采图，Image J软件分析并计算梗死体积。为了避免因患侧脑水肿引起的计算误差，采用以下公式计算:右侧梗死面积=左侧脑组织总面积－右侧正常脑组织面积;相对梗死体积=累积右侧梗死面积/累积正常侧脑组织面积 ×100%［6］。

5．统计学方法:数据录入和处理均采用SPSS 17．0统计软件包，各组数据用均数±标准差(±s)表示，采用两独立样本t检验进行两组均数比较和方差齐性检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．两组大鼠存活情况比较:脑缺血术后24h观察两组大鼠的一般情况，从表1中可以看出组1和组2的死亡率均为10%，无统计学差异。两只死亡大鼠的体重分别为232g和252g，通过尸检发现，组1中死亡大鼠右侧脑水肿明显，蛛网膜下腔无出血，推测死亡原因为脑梗急性期脑水肿导致颅内压升高，脑疝死亡;组2死亡大鼠取脑未发现蛛网膜下腔出血及明显脑水肿，可能死因与麻醉药不耐受、窒息等因素相关。

2．神经功能评分:术后2h对两组大鼠行神经功能评分，方差齐性检验示数据不满足方差齐性(F=15．825，P=0．001 ＜0．05)，选用校正 t检验统计分析。组1神经功能评分的均值为3．00±0．47，组2为1．80±1．32，差异具有显著性(P ＜0．05)，且组 2 的标准差较大，神经功能评分值离散程度高，大鼠个体之间的神经功能评分的差异较大，不稳定;组1中除1只死亡外，评分较一致，比较稳定(图1)。

3．脑梗死体积:组1大鼠取脑时右侧脑组织明显肿胀，右侧大脑中动脉供血区的外侧额、顶、颞部区域颜色苍白，浅于左侧正常组织，TTC染色可见大脑皮质和纹状体部明显白色梗死灶;组2外观脑肿胀不明显，TTC染色示梗死灶多局限于纹状体或无梗死灶(图2)。两组大鼠平均相对脑梗体积分别为23%、8%。差异具有统计学意义(P＜0．05，图3)。

图1 脑缺血2h后各个大鼠的神经功能评分情况

图2 两组大鼠缺血再灌注24h后TTC染色情况

图3 脑缺血再灌注24h后两组大鼠的脑相对梗死体积比较

讨 论

缺血性脑血管病以大脑中动脉供血区的血流阻塞最为常见，大鼠线栓法制备MCAO模型具有不开颅、损伤小，能准确控制缺血及再灌注时间，梗死效果确切等特点，成为研究缺血性脑血管病的病理生理机制的主要动物模型。1986年，Koizumi等［7］首次不开颅经CCA栓入尼龙线闭塞大脑中动脉获得成功，后Longa等［1］于1989年对其进行了改进后，推广此方法广泛应用于实验性脑缺血的研究。Longa等［1］在实验中采用的是4-0的单股尼龙手术线，把栓线头端烧成球形，因其来源困难，各个实验室常以同等直径的鱼线或尼龙线替代，由于制作工艺不一所致栓线头端粗细不定，加之动物的品系，体重及插入深度的不同，而导致实验性脑缺血灶的不稳定。

本课题组在实验过程中购入线长40mm，线身直径0．26mm，头端直径0．36mm并以多聚赖氨酸包被，在19mm处标记黑点的消毒处理后的即用型尼龙栓线，根据使用说明适用于250～280g大鼠。但是在预实验阶段控制大鼠体重范围260～270g，结果发现模型成功率较低。推测原因可能与大鼠品系和造模方法有关。随后根据说明书调整，将大鼠体重降低10～20g，并分组造模，观察此型号栓线适应的大鼠体重。本研究发现体重范围在238±6g(230～249g)的SD大鼠用此栓线能得到稳定的MCAO模型，缺血2h再灌注24h后TTC染色显示梗死灶明显，神经功能评分较一致且大鼠的死亡率较低(10%)。

另外，实验过程中发现，会遇到以下问题:(1)麻醉死亡或不完全:腹腔注射水合氯醛时误将麻药注入股静脉、膀胱、肠腔或皮下，会导致麻醉死亡或不完全，将注射器刺入腹腔后，轻微回抽，无血无水阻力较小时再推进麻药，麻醉不全时可少量补加麻醉药(约0.2ml)，减少因麻醉所致的死亡。(2)是否分离PA:PA位置较深，分离PA时对周围的组织和神经损伤较大，引发大鼠较剧烈的刺激反应，耗时较长，故造模过程中不分离PA，可通过手法调整避开PA，将模型制备时间控制在15min左右。(3)栓线在闭塞大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)之前卡住:有两种情况可以考虑，一为栓线头部进入PA，此时栓线插入深度约8mm，强行用力继续易导致PA破裂，PA位置较深，出血难以止血导致大鼠死亡，可通过调整栓线方向和弧度，避开PA继续向前。二为栓线头部卡在ICA入颅处，此时栓线进入约13mm，此情况较为少见，排除大鼠血管痉挛及调整栓线方向均阻力较大，若确保栓线不在PA，可酌情放弃手术，剔除该大鼠。(4)栓线插入深度:栓线进入约18mm即可达到MCA入口，即可感觉有轻微阻力，不可忽略此阻力继续推送，研究结果显示，栓线插入过深可进入MCA使其彻底闭塞，导致脑梗死面积范围过大或血管壁破裂，导致蛛网膜下腔出血，死亡率增加［6］。(5)栓线固定及拔出:栓线到达指定位置后由双线固定且须松紧适度，太松大鼠清醒后易自行拔出引发ECA断端出血形成血肿，太紧拔线栓时须二次打开伤口解开固定线拔栓线。大鼠清醒状态下拔栓线易引起其剧烈挣扎，栓线易刺破血管膜引发蛛网膜下腔出血，或栓线全部拔出致血液经ECA断端流出，故麻醉后拔出栓线为佳。

通过实验研究笔者发现MCAO模型的成功制作与多种因素相关，最关键因素在于大鼠体重和选择的所用栓线的规格的匹配。故笔者在实验中选择购于公司的规格一致的栓线，以排除人工制作栓线引起的实验误差。本研究结果显示，体重范围在238±6g的SD大鼠采用沙东2636－4A型号的栓线可得到稳定的，可重复的MCAO模型，稳定的动物模型是进一步研究的基础，才能使基于该模型展开的实验研究所得出的实验结果真实可信。

1 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20(1):84－91

2 Liu X，Wang Z，Wang P，et al．Green tea polyphenols alleviate early BBB damage during experimental focal cerebral ischemia through regulating tight junctions and PKCalpha signaling［J］．BMC Complement Altern Med，2013，13(1):187

3 Jokivarsi KT，Liimatainen T，Kauppinen RA，et al．Relaxation along a fictitious field(RAFF)and Z－spectroscopy using alternating－phase irradiation(ZAPI)in permanent focal cerebral ischemia in rat［J］．PLoS One，2013，8(7):e69157

4 Belayev L，Busto R，Zhao W，et al．HU －211，a novel noncompetitive N －methyl－D－aspartate antagonist，improves neurological deficit and reduces infarct volume after reversible focal cerebral ischemia in the rat［J］．Stroke，1995，26(12):2313 －2319，2319 －2320

5 Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al．Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］．Stroke，1986，17(3):472 －476

6 包新杰，赵浩，赵英杰，等．线栓法插线深度对大鼠脑梗死模型制备的影响［J］．中国实验动物学报，2011，19(3):233－236

7 Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T．Experimental studies of ischemic brain edema:1．A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area［J］．Stroke，1986，8(5):1－8