血清异常凝血酶原检测在原发性肝癌临床诊断中的应用

濮珏彪，王学锋，彭奕冰

(上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海200025)

原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma)是全世界最常见的腹部癌症之一，是第五大癌症，占癌症死亡人数的第3位[1]。肝癌的诊断主要依赖于影像学检查和肝组织病理活检等方法，较难普查，为肝癌的早期诊断和筛查带来了困难。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)被认为是肝癌诊断和预后判断的首选血清标志物，但长期的临床实践表明，AFP的特异性和敏感性都不尽如人意。因此，探寻新的血清肿瘤标志物对于早期诊断和预防肝细胞癌具有重要的意义。血清异常凝血酶原又称维生素K缺乏或拮抗剂Ⅱ诱导的蛋白质(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ)，也被称为脱-γ-羧基凝血酶原(Des-γ-carboxy-prothrombin，DCP)，其 γ-羧基谷氨酸结构中1个或多个谷氨酸残基不完全羧化为γ-羧基谷氨酸，导致其失去正常凝血功能。PIVKA-Ⅱ在原发性肝癌患者的血清中阳性率高，被认为是1种特异性强的原发性肝癌标志物[2]。本研究检测原发性肝癌患者和非原发性肝癌者血清AFP和PIVKA-Ⅱ水平，探讨其在原发性肝癌临床诊断中的应用价值，为寻找更好的原发性肝癌实验室诊断指标提供有价值的依据。

材料和方法

一、研究对象

收集来自瑞金医院2012年3至6月住院患者及健康体检者血清365例，其中原发性肝癌患者血清100例，非原发性肝癌患者血清265例。原发性肝癌患者血清标本要求是来源于由病理学诊断或临床诊断[3]为原发性肝癌但未行手术切除的住院患者。非原发性肝癌患者血清标本要求是来源于病理学诊断或临床诊断为无原发性肝癌的患者或健康人群，且未行手术切除时的血清标本，其中包括慢性肝病59例、消化系统肿瘤50例、继发性肝癌50例、其它肝脏病变56例和正常对照50名。

因维生素K和华法林等会影响血清中PIVKA-Ⅱ的含量，所以正在使用这2种药物的研究对象的标本予以剔除。

二、方法

1.标本要求 排除明显溶血、脂血、黄疸或微生物污染等的标本，标本采集后室温保存不超过8 h或2～8℃保存不超过7 d，标本－20℃冻存不超过1个月或－80℃冻存不超过6个月。

2.试验方法 血清AFP采用罗氏Cobas e601全自动免疫分析仪电化学发光法检测，参考范围为＜20 ng/mL;PIVKA-Ⅱ采用酶化学发光法检测，仪器为LUMIPULSE G1200全自动免疫分析仪(已获中国上市许可证)，参考范围为 ＜40 mAU/mL。所用试剂均为原装试剂盒，严格按照试剂说明书操作。测定过程中所有操作均严格按照实验室室内质量控制文件进行。在试验标本检测前、检测中、检测后分别进行质控检测。

三、统计学方法

所有数据采用SPSS 16.0分析软件进行统计。分析不同疾病组间PIVKA-Ⅱ和AFP水平，发现其数据均呈偏态分布，因此采用中位数和四分位数描述不同组间肿瘤标志物表达的差异。采用两独立样本非参数秩和检验比较不同组间AFP和PIVKA-Ⅱ水平，计算各血清标志物检测结果的敏感性、特异性、正确指数、符合率、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值，同时绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲线确定AFP和PIVKA-Ⅱ合适的参考范围，并且对所有标本和原发性肝癌标本AFP和PIVKA-Ⅱ检测结果分别进行直线相关性分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、不同疾病组间AFP和PIVKA-Ⅱ结果分析

原发性肝癌组患者AFP和PIVKA-Ⅱ水平均明显高于其它疾病组和正常对照组 (P＜0.01)。与正常对照组相比，继发性肝癌、慢性肝病和其它肝脏病变组的AFP水平偏高 (P＜0.01)，但明显低于原发性肝癌组。而在PIVKA-Ⅱ的检测结果中，与正常对照组相比，只有原发性肝癌组PIVKA-Ⅱ水平明显升高 (P＜0.01)，继发性肝癌、慢性肝病、其它肝脏病变和消化系统肿瘤组其数值均没有明显差异。见表1。

表1 不同疾病组血清AFP和PIVKA-Ⅱ检测结果比较 [中位数(四分位数)]

二、AFP和PIVKA-Ⅱ单独诊断原发性肝癌的诊断学评价

AFP、PIVKA-Ⅱ判断原发性肝癌的临界值分别为20 ng/mL和40 mAU/mL。由表2可知，与金标准结果相比，AFP共有77例不符，其中37例为假阴性，40例为假阳性;PIVKA-Ⅱ有53例不符，其中26例假阴性，27例假阳性。为进一步分析这2个指标的诊断学价值，采用统计学方法分别计算了其特异性、敏感性、正确指数、符合率、Kappa值、阳性预测值和阴性预测值，见表3。PIVKA-Ⅱ的各项指标均明显优于AFP，其敏感性和特异性都达到了74.00%和89.81%，Kappa值为0.636，说明其与金标准相比一致性较好。

三、ROC曲线分析及最佳临界点确定

以敏感性为纵坐标、1－特异性为横坐标分别绘制AFP和PIVKA-Ⅱ的ROC曲线，见图1。经过统计学分析，AFP和PIVKA-Ⅱ曲线下面积分别为0.789和0.873(P 均 ＜0.05)，说明这 2 项指标在原发性肝癌的诊断中均有较高的意义。此外，PIVKA-Ⅱ曲线下面积明显大于 AFP，提示在本研究中，前者的诊断价值高于后者。

表2 AFP、PIVKA-Ⅱ单独和联合诊断结果与金标准比较

表3 AFP、PIVKA-Ⅱ单独和联合诊断的评价指标

图1 AFP和PIVKA-Ⅱ诊断原发性肝癌的ROC曲线

为了满足敏感性和特异性相对最优，将最接近ROC曲线左上角的点定位最佳临界点，即正确指数(敏感性+特异性－1)最大的点为临界点。通过计算，AFP的最佳临界点为25.97 ng/mL，此时敏感性为63.00%，特异性为84.91%;PIVKA-Ⅱ的最佳临界点为42.5 mAU/mL，此时敏感性为74.00%，特异性为 89.81%，均高于 AFP。

四、AFP和PIVKA-Ⅱ联合诊断原发性肝癌的诊断学评价

联合诊断1指AFP和PIVKA-Ⅱ检测结果均为阳性定义为阳性，联合诊断2指AFP和PIVKA-Ⅱ检测结果只要有1项为阳性即为阳性。联合诊断1作为判断原发性肝癌的标准，其诊断特异性可高达98.49%，以联合诊断2作为判断原发性肝癌的标准，其诊断敏感性可高达81.00%。由此可知，相比单独诊断，联合诊断大大地提高了诊断效能。见表3。

五、PIVKA-Ⅱ和AFP的相关性分析

对全部标本和原发性肝癌标本分别做了AFP、PIVKA-Ⅱ的相关性分析，在全部标本中，2项指标的Pearson相关系数为0.157(P=0.003)，说明两者相关程度很低;在原发性肝癌标本中，2项指标的Pearson相关系数为0.097(P=0.339)，说明两者无相关性。

讨 论

长期以来，原发性肝癌的诊断主要依赖于影像学检查、肝穿刺和血清AFP检测等。AFP作为首个临床上广泛应用于原发性肝癌的血清肿瘤标志物，为临床诊断做出了巨大贡献。近年来，AFP敏感性和特异性的局限性引起了临床和检验人员的注意，特别是AFP阴性的原发性癌患者有逐年上升的趋势[3]。本研究中AFP的敏感性和特异性分别为63.00%和84.91%，阳性预测值为61.17%，单项AFP用于诊断原发性肝癌的结果并不理想。

随着蛋白组学、分子生物学等技术的不断发展和应用，对肝癌肿瘤标志物的研究取得了很大的进展。但是，大多数肝癌的标志物还只处于实验室研究阶段，如高尔基蛋白73[4]、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3[5]、某些生长因子或细胞因子等。这些肿瘤标志物在实验室的研究过程中被发现与原发性肝癌的发生和发展具有密切的关系[6]。然而由于他们本身检测方法的局限或敏感性和特异性的局限性，限制了他们的临床应用价值。如高尔基蛋白73在前期的研究成果中发现其对于诊断原发性肝癌的敏感性和特异性均大于AFP，但目前只有免疫印迹法的检测试剂问世，该法耗时耗力并且重复性和精确度较差[6]。

PIVKA-Ⅱ是一个已经进入临床应用阶段的肿瘤标志物，目前已有商品化的自动化学发光酶联免疫检测试剂盒(LUMIPULSE®PIVKA-Ⅱ)上市。分析研究PIVKA-Ⅱ检测在原发性肝癌诊断中的临床价值，更有利于提高原发性肝癌的诊断水平。本研究选取100例原发性肝癌患者和265例非原发性肝癌患者血清检测其PIVKA-Ⅱ水平，结果表明PIVKA-Ⅱ在诊断原发性肝癌的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值均优于AFP。PIVKA-ⅡROC曲线下面积高于AFP，表明其诊断价值高于血清AFP。当PIVKA-Ⅱ诊断临界点设为42.5 mAU/mL时，其诊断特异性可以提高到89.81%。本研究结果与文献[7]报道基本一致。因此，血清PIVKA-Ⅱ是一个值得推广和应用的肝癌肿瘤标志物。

在实际临床检测中，由于单项肿瘤标志物指标敏感性和特异性有一定的局限性，联合诊断成为1个提高诊断效能的重要方法。有研究表明，肿瘤标志物AFP和癌胚抗原(carcinoem-bryonic antigen，CEA)联合检测使原发性肝癌的检测率提高到84.2%，远高于单项指标在原发性肝癌中的检出率[8]。在本研究中，采用的2种PIVKA-Ⅱ和AFP联合诊断方案，使诊断原发性肝癌的特异性和敏感性分别提高到98.49% 和81.00%，远高于之前的研究结果[8]。因此，PIVKA-Ⅱ在联合检测原发性肝癌中也具有重要的价值。

综上所述，血清PIVKA-Ⅱ对原发性肝癌具有很好的辅助诊断价值，与血清AFP联合检测同时提高了诊断敏感性和特异性。血清PIVKA-Ⅱ可称为临床诊断肝细胞癌的重要指标。

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