鲆鲽类主要病原菌抗血清的制备及应用

甘玲玲，王蔚芳，高淳仁，雷霁霖

（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室，山东青岛266071；2.四川省富顺县水产渔政局，四川富顺643200）

1 前言

随着鲆鲽类养殖业的迅猛发展，疾病问题日显突出，其中细菌性疾病占到鲆鲽类病害发生率的50%以上，包括各种弧菌，如鳗弧菌(Vibrio anguillarum)[1，2]、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)[3]、哈维弧菌(Vibrio harveyi)[4]、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)[5]；引起疖疮病的杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)[6]、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)[7]等；引起腹水病的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)[8]、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)[9]等。

抗血清是指动物经抗原物质刺激后所产生的含有相应抗体的血清，包括抗毒素、抗细菌、抗病毒血清[10]。抗血清在研究中可用作标准阳性血清，在临床应用中则可作为一种良好的治疗性抗体。如伤寒菌的抗血清可用于伤寒病的诊断，甲胎蛋白的抗血清可诊断原发性肝癌，抗猪瘟血清能有效地控制猪瘟的疫情，羊抗犬瘟热异源单血清对犬瘟热有独特的疗效[10～12]。相对于人、畜牧类的抗血清研究，鱼类的抗血清研究应用几乎未见报道。本文用8种鲆鲽类常见病原菌制备灭活疫苗免疫大菱鲆获得抗血清，采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定各抗血清的效价，并对8种病原菌、迟缓爱德华菌蛋白与各菌抗血清之间的免疫交叉反应进行分析，基于此结果初步判断所得抗血清的质量，为进一步探索鲆鲽类细菌性疾病的预防、诊断及治疗奠定基础。

2 材料与方法

2.1 试验鱼及饲养条件

试验用健康大菱鲆购自青岛通用水产有限公司，体重500 g，水温15℃，暂养一周后发现无任何异常情况即开始进行试验，免疫接种前后按常规养殖程序管理。

2.2 菌株来源及接种培养

试验用菌株来自中国海洋大学生命学院，共8株，分别为鳗弧菌、创伤弧菌、哈维弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、鮰爱德华菌和迟缓爱德华菌。取弧菌接种于2216E平板28℃培养24 h，鮰爱德华菌接种于脑心浸液培养基(BHI)中20℃恒温振荡培养48 h，其他非弧菌接种于Luria-Bertani（LB）平板28℃培养24 h。然后将弧菌接种于胰蛋白胨大豆肉汤28℃恒温振荡培养12 h，鮰爱德华菌接种于BHI液体培养基中20℃恒温振荡培养24 h，其他非弧菌接种于LB液体培养基中28℃恒温振荡培养12 h(迟缓24 h)。

2.3 灭活疫苗的制备

将培养的细菌倒入离心管中，4 000 r/m in，20min后，弃上清，收集菌体。用0.85%无菌生理盐水重悬菌体，按表1进行细菌灭活[13～20]。用无菌生理盐水洗脱甲醛，4 ℃，4 000 r/m in，20m in，反复两次，后重悬于无菌生理盐水，并调整浓度为109cfu/m L，以平板培养法检测灭活效果。将弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂分别与灭活各菌液等体积混匀，使用超声波破碎仪进行乳化。制备好的疫苗4℃保存备用。

表1 菌灭活条件Table1 The conditions of bacterial inactivation

2.4 大菱鲆的免疫与采血

试验用鱼随机分为9组，每种疫苗接种三尾，对照组注射等量无菌生理盐水，免疫程序见表2。分别于免疫前及免疫后第2周、第4周、第6周、第8周、第10周、第12周对免疫鱼进行尾静脉采血，分离血清，分装后-20℃保存备用。

表2 免疫程序Table2 The immunization schedule

2.5 菌蛋白来源

试验用迟缓爱德华菌蛋白来自华东理工大学，是一种迟缓爱德华菌免疫保护性抗原，为迟缓爱德华菌鞭毛相关蛋白，专利号：201110095826.7[21]。

2.6 ELISA

1）包被：用磷酸缓冲液将各灭活菌液(107cfu/m L)及迟缓爱德华菌蛋白(2μg/m L)包被于酶标板，每孔50μL，置4℃过夜。

2）封闭：磷酸盐-吐温溶液洗涤，将酶标板扣干，加入5%脱脂牛奶，每孔200μL，37℃恒温封闭1 h。

3）与抗血清的反应：同上洗涤后，加入从1:100开始二倍系列稀释(磷酸盐作稀释液)的各抗血清，每孔50μL，37℃恒温孵育30m in。

4）与单抗及酶标二抗的反应：同样洗涤后，加入用5%脱脂牛奶稀释的鼠抗大菱鲆免疫球蛋白单克隆抗体腹水(本实验室制备并保存)1:25 000稀释液，每孔50μL，37℃恒温孵育30m in；同上洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠抗体(5%脱脂牛奶1:2 000稀释，50μL)，37℃恒温孵育30m in。

5）显色及终止：洗涤后每孔加入可溶性单组分四甲基联苯胺底物溶液50μL并显色10min，然后每孔加终止液(2M H2SO4)50μL，最后用酶标仪测定450 nm处的optical density(OD)值(5m in内读数，P/N≥2.1时判定为阳性，其中P为实验孔读值，N为对照孔读值)。

3 结果

3.1 迟缓爱德华菌抗血清效价变化

迟缓爱德华菌灭活疫苗免疫大菱鲆后第4周开始产生特异性抗体，抗体效价为1:3 200；之后抗体水平逐步升高；第10周抗体水平升高到1:102 400，并维持这一水平至第12周(见表3)。

表3 间接ELISA法测定迟缓爱德华菌灭活疫苗免疫大菱鲆后血清抗体效价的变化Table3 Antibody titer of turbot serum vaccinated with Edward siella tarda by indirect ELISA

3.2 各病原菌抗血清效价

免疫后第10周各病原菌抗血清效价见表4。

表4 8种病原菌抗血清效价Table4 The titer of anti-serum against eight bacterium

3.3 病原菌及菌蛋白与各抗血清的免疫交叉反应

3.3.1 病原菌

运用ELISA法，对8种病原菌与8种病原菌抗血清的免疫交叉反应进行了分析。由图1可以看出，各病原菌抗血清与其对应的病原菌反应最强烈；鳗弧菌抗血清与鮰爱德华菌反应较强，与创伤弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华菌反应较弱；创伤弧菌抗血清与其他7种菌的反应相对较强；哈维弧菌抗血清与其他菌反应都比较弱；溶藻弧菌抗血清与创伤弧菌、豚鼠气单胞菌的反应相对较强，与鳗弧菌、哈维弧菌、嗜水气单胞菌、鮰爱德华菌、迟缓爱德华菌的反应较弱；豚鼠气单胞菌抗血清与鳗弧菌、迟缓爱德华菌的反应较强，与创伤弧菌、哈维弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、鮰爱德华菌的反应较弱；嗜水气单胞菌抗血清与其他7种菌的反应较弱；鮰爱德华菌与其他7种菌的反应较强；迟缓爱德华菌抗血清与其他7种菌的反应较弱。

图1 ELISA检测8种病原菌抗血清与8种病原菌的交叉反应Fig.1 The sesult of eight anti-serum react with eight bacterium

3.2.2 迟缓爱德华菌蛋白

运用ELISA法，检测迟缓爱德华菌蛋白与各细菌抗血清的免疫交叉反应，结果显示，仅迟缓爱德华菌抗血清的效价高，并且效价水平与用迟缓爱德华菌检测结果一致，而其他7种菌的抗血清效价均下降(见图 2)。

图2 ELISA法检测8种病原菌抗血清与迟缓爱德华菌蛋白的免疫反应Fig.2 The result of Edward siella tarda protein reactwith eight kinds of anti-serum

4 结语

本试验利用福尔马林灭活病原菌制备灭活疫苗，肌肉注射大菱鲆获得抗血清，并运用ELISA方法检测各菌抗血清的效价在1:6 400～1:102 400。本研究表明，各菌抗血清具有较高效价，但其效价不同可能是由于大菱鲆对各菌的敏感性不同或抗血清中含有的杂蛋白质等因素造成的，也与各种病原菌本身构成的复杂性相关。

运用ELISA检测方法对8种病原菌与抗血清进行了免疫反应分析，发现8种菌与各自对应的抗血清间的免疫反应最为强烈，但与其他细菌的抗血清亦有微弱的交叉反应；而在应用迟缓爱德华菌菌蛋白与各抗血清的免疫反应进行分析时，发现仅迟缓爱德华菌的抗血清效价高，其他菌的抗血清效价均大幅下降。本结果表明，各菌抗血清具有特异性，可用于鲆鲽类病原菌及迟缓爱德华菌蛋白的检测，但各病原菌与其他病原菌抗血清之间不同程度的交叉反应为抗血清的应用带来一定的影响。

特异性抗血清在临床应用中可用作治疗性抗体，广泛应用于疫病流行早期对未感染动物的短期预防及疫病的早期治疗；在研究中还可用作标准阳性血清用于微生物鉴定及疾病诊断。但是，抗血清的研究和应用中存在以下问题需要解决。

1）抗血清的安全性。新制备的抗血清必须保证没有外源病原，而抗血清中的外源病原如何清除是一个难题。一般情况下，抗血清中的外源病原主要是病毒，清除病毒一般需要进行病毒排除、病毒去除及病毒灭活三个方面的程序，而有效的病毒处理技术还需进一步发展。

2）抗血清的效价。影响抗血清效价的因素主要包括抗原、动物的选择、免疫剂量、次数、间隔时间、血清处理以及保存血清的温度、期限等。因此如何获得高效价特异性抗血清以及如何避免抗血清效价降低是以后的一个研究方向。

鲆鲽类虽然在我国养殖时间较短，但已成为我国海水养殖鱼类的重要组成部分。鲆鲽类养殖以高密度的工厂化养殖模式为主，其疾病问题日益加剧，相关研究也越来越多。本试验制备了鲆鲽类常见病原菌的抗血清并将其应用于检测病原菌及菌蛋白。但抗血清存在着安全性、效价降低、质量等问题，对其研究及应用带来了困扰，目前，还没有有效的方法解决这些问题。在今后的研究中可在如何清除抗血清中外源病原、血清处理及保存方法、提高抗血清质量等方面进行深入研究。

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