皖南黑猪H—FABP基因5"—上游区和第二内含子的多态性分析及克隆测序

张陈华+张似青+杜波+滑志民+郑江平+殷宗俊

摘 要：对皖南黑猪心脏脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因5-上游区和第二内含子的多态性进行分析及克隆测序，为开展皖南黑猪肉质性状分子育种奠定理论基础。采用PCR-RFLP（HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ3种限制性内切酶）分子标记技术，分析了184头皖南黑猪H-FABP基因5-上游区和第二内含子区的遗传变异情况，并对该基因的多态片段进行克隆和测序分析。结果显示：（1）在5-上游区，HinfⅠ位点上存在多态性，等位基因H的基因频率为0.62，表现为中度多态（PIC=0.359 6）；在第二内含子区，HaeⅢ位点上存在多态性，等位基因D的基因频率为0.92，表现为低度多态（PIC=0.130 7）；而MspⅠ位点上尚未检测到多态，基因型均为AA型；HinfⅠ*位点上也存在多态性，等位基因B的基因频率为0.78，表现为中度多态（PIC= 0.282 4）；（2）χ2检验表明，除5-上游区HinfⅠ多态位点外，其他3个位点均达到Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）；（3）对H-FABP基因3个多态片段进行克隆测序分析发现，HinfⅠ-RFLP是由于1 324 bp处存在T→C的突变引起，HaeⅢ-RFLP是由于1811bp处存在C→G的突变引起，HinfⅠ*-RFLP是由于1 970 bp处存在C→T的突变引起。本试验确证了皖南黑猪H-FABP基因5-上游区的多态位点并在第二内含子区检测到了HaeⅢ和Hinf*Ⅰ多态位点，这可为进一步分析H-FABP基因不同基因型与IMF含量的关系，以及确定影响IMF沉积的主效基因提供一定的数据基础。

关键词：皖南黑猪；H-FABP基因；IMF含量；PCR-RFLP；克隆测序

中图分类号：S828 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.01.007

Sequence and Polymorphism Analysis of Wannan Black Pig H-FABP Gene 5-Upstream Region and the Second Intron

ZHANG Chen-hua1， ZHANG Si-qing1， DU Bo1， HUA Zhi-min1， ZHENG Jiang-ping1， YIN Zong-jun2

（1.Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry， Shanghai 201699， China；2. College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei，Anhui 230036， China）

Abstract： This paper analyzed， cloned and sequenced the polymorphism of H-FABP gene 5-upstream region and second intron to provide theoretical basis for the breeding of pork quality traits in Wannan Black Pig. The molecular marker techniques of PCR-RFLP （HinfⅠ， HaeⅢ， MspⅠ3 kinds of restriction enzymes）was used， and the genetic variation of H-FABP gene 5'-upstream region and second intron in 184 Wannan Black Pigs was analyzed， moreover， the corresponding polymorphic fragments was cloned and sequenced. The results showed that： （1） there was polymorphism in loci of the Hinf in 5'-upstream region， and the frequency of allele H was 0.62， showing moderate polymorphism （PIC = 0.359 6）； there was polymorphism in polymorphic loci HaeⅢ in the second intron allele the frequency of D was 0.92， showing low polymorphism （PIC = 0.130 7 ）. While there was no polymorphism detected in the loci of MspⅠ， which genotype was AA genotype. polymorphism of Loci of HinfⅠ* was also existed， the frequency of allele B was 0.78， showing moderate polymorphism （PIC = 0.282 4）； （2） Chi-square test showed that 3 polymorphic sites had reached the equilibrium of Hardy-Weinberg （P>0.05）except the polymorphic site of HinfⅠin the H-FABP gene 5'-upstream region. （3） by cloning and sequence analysising three polymorphic fragments in H-FABP gene， we found that HinfⅠ-RFLP was due to T→C mutation in 1 324 bp， HaeⅢ-RFLP was due to C→G mutation in 1 811 bp and HinfⅠ*- RFLP was due to C→T mutation in 1 970 bp. The polymorphic loci of H-FABP gene in 5-upstream region of Wannan Black Pig was validated， and HaeⅢ and Hinf*Ⅰpolymorphic loci were detected in the second intron. The results provided certain data basis to determine the main effect gene that infect intramuscular fat （IMF） deposition for further investigating the relationship between different genotypes in H-FABP gene and variation in IMF content， whether H-FABP locus was the major gene for IMF deposition.

Key words： Wannan Black Pig； H-FABP gene； IMF content； PCR-RFLP； cloning and sequencing

收稿日期：2013-10-21；修订日期：2013-11-13

基金项目：教育部科学技术研究重点项目（208059）；安徽省教育厅自然科学基金重点项目（KJ2009A114）；上海农林职业技术学院校内科研项目（091327）

作者简介：张陈华（1985—），男，福建南平人，助教，硕士，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。

通讯作者简介：殷宗俊（1967—），男，安徽合肥人，教授，博士，主要从事动物遗传育种研究。

肌内脂肪（Intramuscular fat，简称IMF）含量，与肉质成正相关，影响肉质的风味、多汁性和嫩度，特别是嫩度。该性状属于数量性状，遗传基础受多基因控制，存在主基因效应[1]。常规育种技术在提高瘦肉率和生长速度等方面的同时，伴随着脂肪的减少，而且沉积在肌肉内的脂肪也同时减少，从而导致猪肉品质下降。一般认为2%～3%的IMF含量可产生理想的口感，但目前对瘦肉率的选择已经使猪肉中平均IMF含量下降至1%～1.5%，低于理想的范围[2]。据报道，IMF含量具有较高的遗传力（0.6），而与背膘厚间存在中等偏低的不利遗传相关（0.3）[3-4]。因此，可以对IMF含量进行遗传改良，进而有效地改善猪肉品质。心脏脂肪酸结合蛋白（Heart fatty acid-binding protein， H-FABP）是FABP家族的一员，是一种低分子量（15 Kda）的胞浆蛋白，由H-FABP基因编码，参与细胞内脂肪酸的运输，主要功能是将脂肪酸从细胞膜运送到β-氧化和三酰甘油及磷脂合成部位[5]。H-FABP在胞内与脂肪酸结合，使细胞内外脂肪酸保持一定的浓度差，促进脂肪酸的摄取，进而影响脂肪的沉积[6]。Gerbens等[7-10]通过与人类H-FABP cDNA 噬菌斑杂交分离出含猪H-FABP 基因的λ噬菌体，确定猪H-FABP基因的结构特征并将其定位在猪6号染色体SW316-S0003（16.6 cM）之间，该基因由1.6 kb的上游调控区域、0.2 kb的3-端非转录区、4个外显子和3个内含子组成。其中4个外显子分别编码24，58，34，17个氨基酸，3个内含子的大小分别为4.2，2.5，1.5 kb，该基因主要在心肌、骨骼肌和乳腺中表达[11]。Gerbens研究发现，H-FABP基因在杜洛克猪中存在HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ3个酶切多态位点，并认为H-FABP基因多态性可作为IMF含量的侯选基因。随后又以153头梅山猪的杂交后代作为供试群体，测定了H-FABP基因的多态性、mRNA、蛋白质的表达水平和背最长肌上的IMF含量。结果表明，在HaeⅢ多态位点基因型之间，IMF含量的遗传变异与蛋白质的表达水平无关，而在mRNA水平上存在着显著的差异，H-FABP基因的mRNA与IMF含量显著相关。鉴于前人的研究结果，本试验选取IMF含量较高的安徽省地方优良品种猪即皖南黑猪为试验群体，采用PCR-RFLP方法检测皖南黑猪H-FABP基因5-上游区和第二内含子区不同位点的多态性及检测突变位点的基因型，并对该基因的多态片段进行克隆和测序分析。通过对皖南黑猪H-FABP基因5-上游区和第二内含子区变异位点的确切位置及引起变异的原因分析，旨在为继续研究该基因的不同区域以确定影响IMF沉积的主效基因，及为皖南黑猪的种质资源特性与MAS研究奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 耳样 试验猪为184头（均来安徽丰润生态农业开发有限公司），用耳号钳剪一小块耳组织（约0.5 g），放入盛有1 mL 70%乙醇的1.5 mL Ep管中，采集的样品-20 ℃保存。

1.1.2 试剂 蛋白酶K、Premix Tag （Version 2.0）购自大连宝生物工程（大连）有限公司，内切酶HinfⅠ、HaeⅢ和MspⅠ购自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 参照文献[12]按常规方法进行基因组DNA的提取，将干燥后的DNA溶于100 μL的TE中，并用0.8%的琼脂糖凝胶电泳法检测提取物的质量。

1.2.2 引物设计与PCR扩增 根据GenBank上注册的X98558、Y16180序列，在5-上游区和第二内含子区用Primer 5.0设计2对引物。引物序列见表1，该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR扩增体系组分（25 μL）：其中Premix Tag （Version 2.0）12.5 μL，模板DNA 2 μL，上下引物（20 μΜ）各1 μL，灭菌蒸馏水8.5 μL。

PCR扩增条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 45 s，退火60 ℃45 s，延伸72 ℃2 min，共33个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.3 PCR扩增产物的酶切 以HinfⅠ酶切PCR1扩增产物，以HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ分别酶切PCR2的扩增产物。酶切体系20 μL，其中，PCR产物6 μL，10×Buffer 2 μL，限制性内切酶1 μL，37 ℃反应4 h，酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.4 H-FABP基因 PCR-RFLP片段克隆测序 通过PCR-RFLP分析，将HinfⅠ、HaeⅢ和MspⅠ酶切片段中具有多态性的不同基因型的PCR扩增产物经纯化后送交上海生物工程技术服务有限公司测序。

1.3 统计分析方法

1.3.1 基因频率和基因型频率的计算 其计算公式为：

Pi=（2（ii）+（ij1）+（ij2）+…+（ijn-1）+（ijn））/2

式中，Pi为第i个等位基因的频率；i为纯合复等位基因；ii为第i个等位基因纯合的个体数；jn为与i共显的第n个等位基因；ijn为含有i与jn共显性等位基因的个体数；n为1个群体内个体的总数。由于PCR-RFLP方法的检测结果为共显性等位基因，因此，表型频率即为基因型频率。基因型频率=基因型个体数/测定群体总数。

1.3.2 基因频率和基因型频率的差异显著性检验（χ2独立性检验） 首先根据基因频率计算各种基因型频率的理论值，然后计算χ2。因为本研究资料的自由度df=1，当基因型理论值小于5时，可采用矫正公式：

x2=■■

式中，Ei为理论值，Oi为实际观察值，n为等位基因数。

2.3.3 H-FABP基因的纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量的计算 纯合度公式：

H0=■P■■

式中，Ho为某一位点的纯合度，Pi为第i个等位基因的频率，n为等位基因数。

杂合度计算公式：

He=1-H0 =1-■P■■

式中，He为某一位点的杂合度，Pi为某一位点上第i个等位基因频率，n为某一位点的等位基因数。

有效等位基因数计算公式为：

Ne=1/H0

多态信息含量（polymorphism information content ，PIC）是由Bostein等提出的用于度量群体多态程度的指标，一个标记在群体中的PIC值是根据其等位基因的频率来计算的，其公式：

PIC=1-■P■■-■■2P■■P■■

式中，n为等位基因数目；Pi和Pj分别为第i和第j个等位基因在群体中的频率。PIC值用于对标记基因多态性的估计，PIC>0.5为高度多态，PIC<0.25为低度多态，0.25

2 结果与分析

2.1 皖南黑猪H-FABP基因PCR产物的扩增结果

扩增PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1、图2。PCR扩增产物检测结果显示，扩增片段与目的片段大小一致且特异性较好，可直接进行PCR-RFLP。

2.2 皖南黑猪H-FABP基因PCR-RFLP结果

据GenBank X98558、GenBank Y16180序列可知，H-FABP基因PCR扩增片段长度分别为693，816 bp。在PCR1（693 bp）扩增片段上存在4个HinfⅠ酶切位点，产生339，172，98，59，25 bp 5个片段，其中1 324 bp处为多态性酶切位点，当此酶切位点消失时，172 bp和59 bp片段合并产生231 bp的片段；在PCR2（816 bp）扩增片段上：存在3个HaeⅢ酶切位点，产生405，278，117，16 bp 4 个片段，其中1 811 bp处为多态性酶切位点，当此酶切位点消失时，278 bp和405 bp片段合并产生683 bp的片段；存在1个MspⅠ酶切位点，产生750，66 bp 2个片段，其中在l 878 bp处为多态性酶切位点，当此酶切位点消失时750 bp和66 bp片段合并产生816 bp的片段；存在3个HinfⅠ*酶切位点，产生521，217，47，32 bp 4个片段，其中1 970 bp处为多态性酶切位点，当此酶切位点消失时，217 bp和47 bp片段合并产生264 bp的片段。本试验部分个体H-FABP基因酶切结果见图3～6。

2.3 皖南黑猪群体遗传学分析

对皖南黑猪群体H-FABP基因3个多态酶切位点进行基因型检测，并计算其基因型频率、基因频率及Ho He、Ne、PIC值等，其结果见表2～4。

由表2可知：在皖南黑猪群体中，基因型HH、DD、AA、BB占很大优势，等位基因H、D、A、B分布频率也远高于h、d、a、b。而在MspⅠ位点上尚未检测到多态性，仅发现AA基因型，且在HaeⅢ位点上，只检测到DD、Dd两种基因型尚未发现dd基因型，说明了试验猪群H-FABP基因在这两位点遗传品质的纯合度较高；本试验在5-上游区和第二内含子区均检测到HinfⅠ多态位点。

由表3可知：经χ2适合性检验表明：除5-上游区HinfⅠ多态位点外，其他3个位点的基因频率和基因型频率均达到Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05），说明该群体在适应性方面具有遗传优势，并经过长期进化和选择达到了平衡状态。而导致HinfⅠ多态位点未达到Hardy-Weinberg平衡的原因可能是由于皖南黑猪在实验动物化培育过程中无意间进行了某些人工选择所致。

从表4可以知：693 bp、816 bp的H-FABP基因片段被HinfⅠ酶切后均表现多态，两位点Ho分别为0.529 9，0.659 7，He分别为0.470 1，0.340 3，

Ne分别为1.887 1，1.515 8，PIC分别为0.359 6，

0.282 4，均属中度多态。因此，该试验结果在一定程度上可作为有效的遗传标记用于该群体遗传资源评价的建议性指标；HaeⅢ位点上，Ho为0.859 4，He为0.140 6，Ne为1.163 6，PIC为0.130 7，属低度多态；由于MspⅠ位点未检测到多态，因此其Ho为1，He为0，Ne为1，PIC为0。导致HaeⅢ、MspⅠ这两位点结果的原因可能是：（1）本试验猪群处在一个封闭的环境中，较少有外界其他猪种血缘的进入，并通过长期的群体内部自然近交，使得有利基因不断纯化，同时也使一些等位基因发生了丢失，从而导致其PIC的降低；（2）这两个基因座比较保守；（3）本试验样本量较小所致。

2.4 皖南黑猪H-FABP基因测序结果

将测序结果与猪H-FABP基因DNA序列（GenBank，登录号为X98558、Y16180）进行比对，结果显示：在5-上游区，所扩增的693 bp的片段1 324 bp处发生T—C突变，从而形成两个等位基因H和h（图7）；在第二内含子，所扩增的816 bp的片段1 811 bp处发生G—C突变，从而形成两个等位基因D和d（图8）；而在1 489 bp处尚未发现多态突变位点，其测序结果如图9所示；在1 970 bp处发生C—T突变，从而形成两个等位基因B和b（图10）。

3 讨 论

Gerbens等[8-9]利用限制性内切酶HinfⅠ、HaeⅢ和MspⅠ对荷兰长白猪、杜洛克、大白、汉普夏、梅山、皮特兰和野猪的H-FABP基因5-上游区和第二内含子区进行PCR-RFLP检测发现，除梅山猪和汉普夏猪未检测到HaeⅢ和MspⅠ多态位点外，其他猪种均检测到3个酶切多态位点。庞卫军等[13]的研究表明在HaeⅢ和MspⅠ多态位点上，所检测的荣昌猪、内江猪和八眉猪在这两位点上均无多态性，并认为中国地方品种猪在这两位点上多态型缺乏，地方品种内IMF的差异主要是由于5-上游区HinfI多态位点的不同基因型所致。张桂香等[14]通过研究发现，北京黑猪、二花脸猪、金华猪、小梅山猪、皖南花猪、滇南小耳猪、香猪、荣昌猪和大白猪中均存在一个HinfⅠ多态位点，且均未发现MspⅠ多态位点，而HaeⅢ多态位点仅出现在皖南花猪和大白猪中，该研究首次报道了在皖南花猪H-FABP基因第二内含子区中存在Hinf*多态位点。本试验在皖南黑猪中验证了H-FABP基因5-上游区HinfⅠ和第二内含子区HaeⅢ多态位点，而在第二内含子区尚未发现MspⅠ多态位点。另外，本试验还在第二内含子区中检测到了Hinf*Ⅰ多态位点。该结果与张桂香的报道的研究结果基本一致。在HaeⅢ位点的检测结果中，本试验猪群与中国其他地方品种猪的检测结果有一定的差异，而与张桂香检测的皖南花猪基本一致，产生这一结果可能原因是：（1）皖南花猪和皖南黑猪主要分布于皖南山区，其地理位置、气候条件和生长环境相近，进而使得这两个地方品种猪的检测结果一致；（2）由于研究群体的遗传背景不同所致；（3）与本研究所选用的群体规模较小有关。本试验只发现两种基因型DD、Dd尚未发现基因型dd，是否存在另外一种基因型尚需进一步扩大试验规模进行验证。

国内外研究表明：在猪H-FABP基因中，3种内切酶（HinfⅠ， HaeⅢ， MspⅠ）所检测的每一种PCR-RFLP，其纯合基因型间IMF含量差异显著，且aaddHH型（MspⅠ-a， HaeⅢ-d， HinfⅠ-H） 具有最高的IMF含量[8-9，13]。国外品种猪肉的IMF含量较低，为2%左右，只有杜洛克猪的IMF含量相对较高。我国地方猪种的IMF含量一般处于中等到丰富的水平之间（3%～7%）[15]。本试验结果发现，皖南黑猪H-FABP基因在5-上游区Hinf I-位点上表现出丰富多态性。HinfI多态位点位于5-上游区域，可能由于该区域的变异影响H-FABP基因的表达，进而影响IMF的含量[9-10]。另外，4个位点的基因频率A、D、H和B占有明显优势，这一试验结果也可能与皖南黑猪作为脂肪型猪IMF含量较高有关。

H-FABP基因位于6号染色体上，其可能的连锁顺序为：S0035-[11.7]-SW2406-[29.9]-SW1057-[29.6]- S0220-[12.7]-SW316-[5.1]-HABP-[11.5]-S0003-[51.3]- SW2419[9]，这一染色体区域被认为是影响脂肪性状的QTL区域。在该染色体上还定位了激素敏感脂肪酶基因（HSL）[16]、磷酸葡萄糖脱氢酶基因（PGD）[17]等基因，这两个基因多态性与猪的背膘厚、眼肌面积显著相关[18-19]。此外，猪瘦素受体基因（LEPR）也定位于该染色体上，该基因可能是影响脂肪性状的一个潜在的候选基因[20]。上述几个基因间是否存在连锁及相互之间的关系如何目前尚不清楚。因此，需联合更多相关的候选基因或DNA 标记来进行分析，寻求与IMF沉积紧密连锁的遗传标记，并进一步确定H-FABP不同基因型与IMF 的关系，以便在动物育种实践的标记辅助选择（MAS） 中发挥遗传改良的作用。另外，值得注意的是H-FABP本身是牛、鼠、人培养乳腺上皮细胞的生长抑制因子[21]，H-FABP的变异情况是否是造成皖南黑猪体型小，生长缓慢的原因之一尚有待研究。

4 结 论

本试验通过对皖南黑猪H-FABP基因5-上游区和第二内含子区变异位点的确切位置及引起变异原因的分析，确定了4个变异酶切位点的位置和突变的碱基序列。这为进一步开展皖南黑猪肉质性状分子育种提供了基础数据，并为继续研究该基因的不同区域，寻找更多的多态性及确定影响IMF沉积的主效基因奠定理论基础。

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