uPA、Ki－67和VEGF在宫颈癌组织中的表达及相关性研究

刘 嵘， 濮德敏， 祝 达， 李 天

华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科，武汉 430030

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。宫颈癌的发生、发展是一个多步骤、多因素的复杂过程。尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase－type plasminogen activator，uPA）是一种丝氨酸蛋白水解酶，是人体纤溶酶原激活剂的一种。它通过降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM），促进肿瘤细胞向周围组织浸润、向远处器官转移［1］。肿瘤的生长主要依靠血管供应营养和氧气，各种肿瘤细胞无限制、侵袭性生长的一个重要前提是新生血管的生成，它为肿瘤细胞的生长、发展、侵袭及转移提供了更多的机会，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是特异性最高的促血管内皮细胞分裂增殖的生长因子，VEGF能刺激血管内皮细胞分裂与增殖，改变内皮细胞的某些基因表达，增加微血管通透性，从而有利于肿瘤的血管生成、浸润和转移。Ki－67抗原是一种DNA结合蛋白，与细胞的有丝分裂相关，Ki－67抗原可用于辨别生长中的正常细胞和肿瘤细胞的增殖状态。本研究采用免疫组化SP法检测宫颈癌组织中uPA、Ki－67、VEGF的表达情况，探讨三者在宫颈癌发生、发展过程中的相互关系。

1 资料与方法

1．1 对象

选取2012年10月至2013年7月华中科技大学附属同济医院病理科保存的石蜡包埋组织切片200例，其中94例宫颈浸润癌（ICC），按宫颈癌苏木精－伊红（HE）病理切片诊断标准确诊和FIGO（2009年标准）分期，Ⅰa期20例，Ⅰb期20例，Ⅱa期23例，Ⅱb期31例；组织学分级：G125例，G220例，G349例；病理学类型：鳞癌70例，腺癌24例；盆腔淋巴结转移31例；患者年龄为25～70岁，中位数年龄43岁，年龄≤40岁43例，＞40岁51例。宫颈上皮内瘤样病变（CIN）83例，为同期行宫颈锥切或子宫全切标本，其中CINⅠ级36例，CINⅡ～Ⅲ级47例。所有患者术前均无化疗或放疗等特殊治疗。另取同期因子宫肌瘤行子宫全切术的正常宫颈组织（NCE）标本23例作为对照，所有标本均经病理学检查确诊。

1．2 方法

所有标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋、4 μm连续切片，uPA、VEGF与Ki－67均采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶（SP）连接法检测，按说明书常规操作，一抗及试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，每批实验同时设立阳性和阴性对照，用已知的免疫组化染色阳性的宫颈切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1．3 结果判断

采用双盲法，由2位病理学教授独立观察每张切片后共同做出判断。uPA和VEGF染色阳性信号均为胞质内出现棕黄色颗粒，Ki－67阳性物质棕黄色颗粒均位于细胞核。判断方法在400倍的光镜下随机观察10个视野，计算出肿瘤细胞中阳性细胞所占的百分比。uPA、Ki－67和VEGF阳性细胞比例≥10%为阳性，＜10%为阴性。

1．4 统计学处理

采用SPSS 16．0统计软件。半定量资料比较用χ2检验或四格表精确概率法检验，数据相关性分析采用Pearson相关分析，以α＝0．05为显著性检验水准。

2 结果

2．1 uPA、VEGF与Ki－67蛋白在NCE、CIN和ICC组织中的表达情况

uPA蛋白从NCE到CIN再到ICC，uPA阳性表达率均显著升高（P＜0．05或P＜0．01）。uPA在CIN中主要表达于异型细胞和上皮细胞的细胞质和／或细胞膜，染色呈黄色、棕黄色；在ICC组织中表达于肿瘤细胞膜及细胞质内，染色呈棕黄色或棕褐色。VEGF蛋白在ICC组织中的阳性表达率明显高于CIN及NCE（P＜0．01）。VEGF在CIN组织中主要表达于异型细胞膜和／或细胞质；在宫颈癌细胞中主要分布于肿瘤细胞质，胞膜及少量胞外基质，血管内皮细胞也有阳性表达。Ki－67蛋白阳性表达率在病变不同阶段呈显著上升趋势（P＜0．01）；Ki－67在CIN组织中主要表达于异型细胞核；在宫颈癌组织中主要表达于癌细胞核。见表1、图1。

表1 uPA、VEGF和Ki－67在不同宫颈组织中的表达Table 1 Expressions of uPA，VEGF and Ki－67in different cervical tissues

2．2 uPA、VEGF与Ki－67在ICC中的表达与临床病理参数的关系

uPA蛋白在ICC组织临床分期为Ⅱ期中的阳性表达率明显高于临床分期为Ⅰ期者（P＜0．01）；有盆腔淋巴结转移者的阳性表达率明显高于无盆腔淋巴结转移者（P＜0．01）；uPA蛋白阳性表达与患者年龄、病理学类型及组织学分级无关。VEGF蛋白在ICC组织临床分期为Ⅱ期中的阳性表达率明显高于临床分期为Ⅰ期者（P＜0．01）；有盆腔淋巴结转移者的阳性表达率明显高于无盆腔淋巴结转移者（P＜0．01）；VEGF蛋白表达与宫颈癌组织学分级、病理学类型及年龄无关（P＞0．05）。Ki－67蛋白在ICC组织临床分期为Ⅱ期中的阳性表达率明显高于临床分期为Ⅰ期者（P＜0．01）；Ki－67蛋白表达与宫颈癌组织学分级、病理学类型、有无盆腔淋巴结转移及年龄无关（P＞0．05）。

图1 uPA、VEGF和Ki－67在CIN和ICC组织中的表达（×400）Fig．1 Expressions of uPA，VEGF and Ki－67in CIN and ICC tissues（×400）

2．3 ICC组织中uPA、VEGF与Ki－67蛋白表达的相关性

uPA表达阳性的67例ICC组织中，VEGF蛋白阳性表达67例，uPA表达阴性的27例ICC组织中，VEGF蛋白阳性表达5例，uPA蛋白的表达情况与VEGF蛋白表达呈正相关（r＝0．871，P＜0．01）；uPA表达阳性的67例ICC组织中，Ki－67蛋白阳性表达59例，uPA表达阴性的27例ICC组织中，Ki－67蛋白阳性表达4例，uPA蛋白的表达情况与 Ki－67蛋白表达呈正相关（r＝0．705，P＜0．01）；VEGF表达阳性的72例ICC组织中，Ki－67蛋白阳性表达60例，VEGF表达阴性的22例ICC组织中，Ki－67蛋白阳性表达3例，VEGF蛋白的表达情况与 Ki－67 蛋白表达呈正相关 （r＝0．628，P＜0．01）。

3 讨论

uPA是高效能的丝氨酸蛋白水解酶。它主要是在生理、病理的条件下，参与各种细胞的分化、增殖、迁移、细胞周围基质降解以及组织重建等。恶性肿瘤细胞分泌的是尿激酶型纤溶酶原激活因子的无活性前体pro－uPA，它与其相应的受体uPA－R结合形成有活性的uPA，有活性的uPA可激活纤溶酶原，使其变成纤溶酶，从而降解肿瘤ECM中的各种成分，促进细胞的增殖、分化及迁移［2－3］。目前研究发现，uPA在多种肿瘤细胞中表达，如结肠癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌及乳腺癌等。本研究结果显示，uPA蛋白在ICC组织中阳性表达率显著高于CIN及正常宫颈组织；在临床分期为Ⅱ期、有盆腔淋巴结转移者，uPA蛋白阳性表达率分别显著高于临床分期为Ⅰ期、无盆腔淋巴结转移者；但与患者年龄、病理学类型及组织学分级无关。

VEGF又称血管渗透性因子，可以促进内皮细胞增殖及血管新生，提高血管通透性，改变细胞外基质的成分和结构。已有研究表明，在ICC及CIN中均有VEGF蛋白及其mRNA的过度表达。宫颈癌早期转移是通过淋巴系统转移，血管内皮生长因子VEGF－C及其受体在早期子宫颈癌淋巴结转移中起着主要 作 用［4－5］。Cheng 等［6］研 究 表 明，宫 颈 癌 中VEGF过度表达与肿瘤大小、深层间质浸润、宫旁浸润和盆腔淋巴结转移有关，认为VEGF可能是一个有价值的宫颈癌预后指标。本研究表明，从NCE到CIN再到ICC，VEGF蛋白阳性表达率显著增高，在临床分期为Ⅱ期、有盆腔淋巴结转移者，其VEGF阳性表达率分别显著高于临床分期为Ⅰ期、无盆腔淋巴结转移者。

以往的研究显示，Ki－67的表达从正常宫颈、癌前病变至宫颈癌呈增高趋势，差异有显著性，被认为是目前反映宫颈癌细胞增殖活性非常敏感、准确的生物学指标。在本实验中我们亦发现，Ki－67蛋白在ICC组织中的表达率显著高于正常宫颈组织及CIN组织；在临床分期为Ⅱ期者，Ki－67阳性表达率显著高于临床分期为Ⅰ期者，差异具有统计学意义；但Ki－67与宫颈癌组织学分级、病理学类型、有无盆腔淋巴结转移及年龄无相关性。

近年来研究表明，肿瘤的形成和发展是受多因素及多基因决定的，某一因素或某一基因不能完全解释肿瘤生长、转移的全貌，因此，主张多个指标联合检测，观察它们在肿瘤组织中的表达及差异，以深入了解肿瘤的发病机制和判断肿瘤的生长及转移特性，为患者的病情进展、预后判断提供较好的预测指标，并有利于临床医生对患者提供有效的治疗方案。我们在前期的研究中发现［7］，新辅助化疗前后，uPA、VEGF及Ki－67的表达有显著性差异，表达明显下降（P＜0．05）；uPA、VEGF阴性患者的化疗效果优于uPA、VEGF阳性者（P＜0．05）；Ki－67高表达的患者新辅助化疗效果明显好于低表达者（P＜0．01）。在本研究中，Ki－67与VEGF在宫颈癌组织中的表达呈正相关，提示Ki－67与VEGF在肿瘤进展中起协同作用。同时，我们还发现uPA阳性表达的肿瘤组织中VEGF和Ki－67蛋白表达也趋于阳性，uPA与VEGF、Ki－67在宫颈癌组织中的表达呈正相关，尤其是在临床分期为Ⅱ期者，三者的阳性表达率均显著高于临床分期为Ⅰ期者，提示三者在宫颈癌向周围组织侵袭过程中亦起着协同作用，但其间是否存在着因果关系还不十分清楚。综上所述，联合检测uPA、VEGF和Ki－67可辅助监测宫颈癌的发生发展，是宫颈癌早期诊断、预后评价的有效手段。

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［6］ Cheng W F，Chen C A，Lee C N，et al．Vascular endothelial growth factor in cervical carcinoma［J］．Obstet Gynecol，1999，93（5Pt 1）：761－765．

［7］ 刘嵘，李天，何泓，等．宫颈癌新辅助化疗前后uPA、VEGF和Ki67的表达及其临床意义［J］．华中科技大学学报：医学版，2013，42（6）：712－714．