益气消法中药含药血清对人脐静脉内皮细胞株细胞增殖、迁移及凋亡的影响

刘丽丽，李 爽，李海东，宋卓敏

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津医科大学生物化学与分子生物学系，天津 300070；3.天津中医药大学中医药研究院，天津 300193）

1 材料与方法

1.2 含药血清制备 选SD大鼠，体质量（375±25）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验前，置动物于室内适应环境，常规喂养1周。将体质量≥400g或者≤350g的SD大鼠予以剔除。共体质量相近的SD大鼠50只，按随机数字表法分为4组：正常对照组、中药高、中、低剂量组，每组10只。正常对照组：给予蒸馏水。中药高、中、低剂量组：用药剂量为根据人的日用药量，按大鼠体表面积比率换算成等效剂量的2、1、0.5倍，具体数据分别为4、2、1g/kg干粉（相当于18、9、4.5g/kg生药）。每次1mL/100g体质量，每天2次，间隔10h，连续灌胃5d，第5天上午灌服药物后1h腹主动脉取血，离心处理后，取血清2mL左右，置于无菌试管中，56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，密封，-20℃冰箱中冻存。

1.3 实验试剂和仪器 17β-雌二醇（美国Sigma公司）；ICI-182780（美国Sigma公司）。人脐静脉内皮细胞（EA.hy926）购自中国科学院上海细胞库，体外培养传代；DMEM培养基（美国GIBCO）；优质小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；MTT粉（北京天港邦定生物医学科技有限公司）；二甲基亚砜（上海菲达有限公司）；青、链霉素（华北制药股份有限公司）；流式细胞仪（FCM，Becton-dickinson公司）。

1.4 研究方法

1.4.1 细胞培养 人脐静脉内皮细胞株（EA.hy926），接种于含10％小牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养，至EA.hy926细胞生长成单层后备用。

1.4.2 细胞分组及干预 培养的EA.hy926细胞，随机分为6组：正常对照血清组；17 β-Estradiol组（简称E2组）；E2加ICI 182，780组（简称E2加ICI组）；E2加中药高剂量含药血清组；E2加中药中剂量含药血清组；E2加中药低剂量含药血清组。用DMEM培养液配成终浓度为15％的含药血清或对照血清，E2终浓度10-8mol/L，ICI终浓度10-7mol/L。

1.4.3 MTT法检测EA.hy926细胞增殖 将对数生长期的EA.hy926细胞，胰酶消化后细胞计数，以5×105个/L浓度接种于96孔培养板，200μL每孔，常规培养过夜，使细胞贴附，孵育24h后，弃原培养液，换新鲜培养液，180μL每孔。根据实验分组设计将不同浓度的含药血清及试剂以每孔20μL量加入。继续孵育48h后，每孔加入MTT 20μL，继续孵育4h。倾去药液及培养液，每孔加入二甲基亚砜150μL，振荡10min，37℃继续孵育，直至镜下观察二甲基亚砜全部溶解后，以自动酶标仪，490nm波长测定吸光度值（A值），每组6个复孔，重复实验3次，取其平均值。

1.4.4 划痕法检查EA.hy926的迁移能力 将对数生长期的EA.hy926细胞，胰酶消化后细胞计数，以5×105个/L浓度接种于6孔培养板。常规培养过夜，使细胞贴附，孵育24h后，弃去培养基，用无血清培养基漂洗1次，此时用无菌的枪头（tips）沿各孔中轴均匀划一道裸露的无细胞带，用PBS漂洗划下的细胞2～3次。根据实验分组设计加入无血清的DMEM培养液配制的不同浓度的含药血清及试剂，每组均设6个平行孔，以这一时间点作为零时间点，后置于培养箱内继续培养48h，分别在0、48h两个时间点，在倒置显微镜下观察同一位置的细胞迁移情况，拍照记录。每孔随即选择测3个视野，取平均值计算细胞迁移数。重复实验3次。

1.4.5 流式细胞术检测EA.hy926细胞凋亡率 将对数生长期的EA.hy926细胞，胰酶消化后细胞计数，以5×105个/L浓度接种于6孔培养板，常规培养过夜，使细胞贴附，孵育24h后，弃原培养液，换新鲜培养液。根据实验分组设计加入不同浓度的含药血清及试剂。继续孵育48h后，胰酶消化（无EDTA），迅速加入收集的培养液终止消化反应。1 500r/min离心5min，弃上清，收集细胞于10mL离心管中。4℃预冷的PBS洗2次。用PBS结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为106细胞/mL。取200μL细胞悬液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V-FITC（150mg/L）和5μL碘化丙锭（PI，120mg/L），混匀后室温避光孵育15min，在反应管中加500μL PBS，流式细胞仪分析。重复实验3次。

1.4.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件，数据用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较应用One-way ANOVA进行统计学分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 实验结果

表1 各组EA.hy926细胞增殖、迁移数、细胞凋亡的比较（±s，n=18）

表1 各组EA.hy926细胞增殖、迁移数、细胞凋亡的比较（±s，n=18）

注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与E2组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与E2加中药高剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组 别 细胞增殖 细胞迁移数/个 细胞凋亡率/％正常对照血清组 0.433±0.044△△▲ 170.39±10.56△△▲▲ 8.021±0.641△△▲▲E2组 0.602±0.027##▲▲ 214.56±14.78##▲▲ 5.418±0.873##▲▲E2加ICI组 0.447±0.017△△▲▲ 174.39±10.98△△▲▲ 7.643±1.020△△▲E2加中药高剂量含药血清组 0.478±0.015△## 187.94±9.43##△△ 6.514±0.580##△△E2加中药中剂量含药血清组 0.521±0.022##△△▲▲ 199.39±14.59##△△▲ 5.333±0.950##▲▲E2加中药低剂量含药血清组 0.587±0.223##▲▲ 209.33±26.51##▲▲ 5.457±0.676##▲▲

如表1所示：正常组EA.hy926细胞的增殖低于E2组、E2加中药中、低剂量组（P＜0.01）、E2加中药高剂量组（P＜0.05），与E2加ICI组相比无显著性差异（P＞0.05）；E2组高于除E2加中药低剂量组外的其它各组（P＜0.01），与E2加中药低剂量组比较无统计学意义（P＞0.05）；E2加中药高剂量组EA.hy926细胞的增殖显著低于E2加中药中、低剂量组（P＜0.01），高于E2加ICI组（P＜0.01），E2加中药中剂量组显著低于E2加中药低剂量组（P＜0.01）。

正常组EA.hy926细胞迁移数显著低于E2组、E2加中药高、中、低剂量组（P＜0.01），与E2加ICI组相比无显著性差异（P＞0.05）；E2组高于除E2加中药低剂量组外的其它各组（P＜0.01），与E2加中药低剂量组比较无统计学意义（P＞0.05）；E2加中药高剂量组低于E2加中药中剂量组（P＜0.05）及E2加中药低剂量组（P＜0.01），显著高于E2加ICI组（P＜0.01），E2加中药中剂量组低于E2加中药低剂量组（P＜0.05）。

正常组EA.hy926细胞凋亡率显著高于E2组、E2加中药高、中、低剂量组（P＜0.01），与E2加ICI组相比无显著性差异（P＞0.05），E2组显著低于除E2加中药中、低剂量组外的其它各组（P＜0.01），与E2加中药中、低剂量组相比无统计学意义（P＞0.05）；E2加中药高剂量组EA.hy926细胞凋亡率显著高于E2加中药中、低剂量组（P＜0.01），低于E2加ICI组（P＜0.05）；E2加中药中剂量组与E2加中药低剂量组比较无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

本研究结果显示，经E2处理的EA.hy926细胞，其增值、迁移明显高于正常组，细胞凋亡率明显低于正常组；而ICI和益气消法中药均可明显阻断E2对EA.hy926的细胞的增值、迁移的促进作用，阻断E2对EA.hy926细胞的凋亡的抑制作用，与E2组比较有显著差异（P＜0.01）。据现代药理研究该方中多味中药有抗肿瘤血管生成作用。党参提取物对紫杉醇抑制血管生成和移植肿瘤转移有一定的增强作用［2］。莪术油注射液对小鼠移植性S180肉瘤血管形成有抑制作用［3］。续断有抑制子宫收缩、调节机体免疫、改善局部血循环、促进血肿的吸收机化、抗感染等药理作用［4］。鳖甲有调节机体免疫、抗肿瘤、抗突变、抗纤维化等药理作用［5］。白芥子有抗肿瘤、抗雄激素、抑菌等药理作用［6］。郁金及其提取物有保护染色体突变的作用，对癌细胞有明显的抑制作用［7］。此为益气消法中药干扰血管生成过程，抑制血管新生，从而抑制子宫肌瘤血管生长、肌瘤发展的原因之一。但其具体机制尚需进一步探讨。

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［3］冯刚，黄涛，卢宏达，等.莪术油注射液对小鼠移植性S180肉瘤血管形成的抑制作用［J］.肿瘤研究与临床，2005，17（4）：233.

［4］晏媛，郑萍.续断的药理学研究进展［J］.中医药研究，2002，18（5）：53-54.

［5］温欣，周洪雷.鳖甲化学成分和药理药效研究进展［J］.西北药学杂志，2008，23（2）：122-124.

［6］欧敏锐，吴国欣，林跃鑫.中药白芥子研究概述［J］.海峡药学，2001，13（2）：8-11.

［7］何必立，吕宾，徐毅，等.郁金对胃癌细胞的抑制作用及其对血管内皮生长因子表达的影响［J］.中医药学刊，2006，24（9）：1741-1743.