油茶粕最优培养基及混菌生产蛋白饲料的研究

马 力，陈永忠 ，彭邵锋 ，王湘南 ，陈隆升，王 瑞 ，杨小胡 ，罗 健

（1.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004；2.国家油茶工程技术研究中心，湖南 长沙 410004）

油茶粕最优培养基及混菌生产蛋白饲料的研究

马 力1,2，陈永忠1,2，彭邵锋1,2，王湘南1,2，陈隆升1,2，王 瑞1,2，杨小胡1,2，罗 健1,2

（1.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004；2.国家油茶工程技术研究中心，湖南 长沙 410004）

以油茶粕为原料，筛选生产蛋白饲料的最优培养基及菌种组合。首先对油茶粕进行成分分析，结果表明：两组处理蛋白质含量均为9%以上，是一种很好的饲料原料；接着以米曲霉初筛油茶粕生产蛋白饲料的发酵培养基，获得了较优的培养基配方为：热水脱皂的油茶粕16 g，麦麸1 g，葡萄糖2 g，(NH4)2SO41 g，水19 g。最后，通过平板点种试验及三角瓶发酵培养，获得油茶粕生产蛋白饲料的最佳菌种组合及接种比例：地衣芽孢杆菌10181︰黑曲霉︰葡萄汁酵母1445︰米曲霉=1︰1︰1︰1。发酵生成的粗蛋白含量为16.94%，较未发酵时的10.82%，提高了56.56%。

油茶粕；混菌；蛋白饲料

油茶Camellia oleifera Abel.，又称茶油树、白花茶、中果油茶、茶子树等，属山茶科Theaceae山茶属Camellia L．植物是我国特有的木本食用油料树种，有2300多年的栽培和利用历史，与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物，与乌桕、油桐和核桃并称为我国四大木本油料植物[1-3]。目前，我国油茶面积约有300万hm2，油茶籽年产量100万 t左右，年产茶油约26万 t，产值约110亿元[4-5]。

油茶全身都是宝。叶可净化空气，绿化环境；花可观赏，作蜜源；根可保持水土，涵养水源；根皮还可入药；茎质地细密，韧性较好，可用于制作木器、农具等；种子榨取的油—茶油是一种优质食用油，不饱和脂肪酸含量高达90%以上，以油酸为主，还富含亚油酸和亚麻酸、维生素E、生育酚、角鲨烯等营养成分，被誉为“东方橄榄油”，联合国粮农组织重点推荐为健康型高级食用植物油[6-7]；茶油还能通过油脂的深加工生产高级保健食用油和高级天然护肤化妆品等；油茶粕可提取茶皂素、制刨光粉和复合饲料[8]；茶壳可提糠醛、鞣料和制活性炭等[9]，发展油茶生产对提高我国国民经济和人民生活水平具有重大意义。

油茶粕是油茶提油后的剩余物，近年我国年产油茶粕70多t，但大多数被废弃掉或廉价出口到东南亚等国，有效资源未得到充分利用。我国钟海雁教授、邓桂兰教授等已做过相关研究证实，油茶粕通过菌种发酵，可使部分糖类、纤维素等主要成分转化成蛋白质[10-11]。本研究通过优化培养基和高效发酵菌株的筛选，以达到提高油茶粕蛋白质的目的。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

米曲霉、黑曲霉、葡萄汁酵母1445、热带假丝酵母1779、地衣芽孢杆菌10181、枯草芽孢杆菌（均购于湖南省微生物研究所）。

1.2 试验原料

油茶粕（购于湖南农业大学油脂与蛋白质实验室），将油茶粕置于70℃电热鼓风恒温干燥箱中烘干至水分不再发生变化。

1.3 试验方法

1.3.1 热水脱皂

油茶粕粉碎、过筛→加3倍清水→煮沸2 h（不断搅拌，以防止焦灼）→过滤，滤渣在清水中浸泡24 h，反复洗涤，除去上层溶液→过滤，烘干备用。

1.3.2 培养基优化

米曲霉是一类产复合酶的菌株，可分解油茶饼粕中的粗蛋白质、纤维素、糖类物质等，故试验用米曲霉初步筛选发酵培养基。以油茶粕为主，麦麸为辅，设计了4种培养基配方，见表1。以米曲霉发酵，在温度28℃下培养3 d。发酵完后测定培养基中蛋白质的含量。

表1 培养基配方Table 1 Formulas of mediums

1.3.3 配伍菌种筛选

将白地霉、黑曲霉、米曲霉、地衣芽孢杆菌10181、热带假丝酵母1779及葡萄汁酵母斜面分别用无菌水洗下，30℃摇床振荡培养48 h，分别接入到饲用油茶饼粕发酵培养基中，28℃下培养72 h，观察固体平板上各菌株的生长情况，同时，测定培养基发酵前后蛋白质含量的变化。

根据各试验菌的发酵结果，选用黑曲霉为指示菌。将黑曲霉接种于优化的培养基中，28℃下培养48 h后，再分别点种其他待选菌，28℃下培养72 h，观察各菌株的生长情况。

1.3.4 菌种比例及组合优化

根据平板点种刺激圈试验，选择与指示菌配伍的菌种2株，组成A组菌和B组菌。

(1) A组菌两菌株接种比的确定。将斜面菌种用无菌水洗下，以接种比为5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5，接种量为10%，分别接入到三角瓶发酵饲用油茶饼粕发酵培养基中，28℃生化培养箱培养72 h后，105℃烘干至恒重，测定其粗蛋白含量。

(2) B组菌两菌株接种比的确定方法同A组菌。

(3) 4个菌种的混合比。将斜面菌种用无菌水洗下，以A组菌与B组菌的接种比分别为5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5，接种量为10%，分别接入到三角瓶发酵饲用油茶饼粕发酵培养基中，28℃生化培养箱培养72 h后，105℃烘干至恒重，测定其粗蛋白含量。

1.4 测定方法

蛋白质含量测定：凯氏定氮法（GB/T5009.5-2003）；

粗脂肪的测定：索氏抽提法；

粗纤维含量测定：重量法；

可溶性总糖测定：蒽酮法；

皂素的测定采用：比色法[12]。

2 结果与分析

2.1 油茶粕化学成分分析

油茶粕的主要成分包括蛋白质、茶皂素、粗纤维、可溶性糖等。将油茶粕和热水脱皂的油茶粕进行成分测定，测定结果见表2。

表 2 油茶粕主要化学成分†Table 2 Main chemical composition of oil-tea camellia meal %

从表1可以看出，两组处理蛋白质含量均为9%以上，是一种很好的饲料原料。热水脱皂后的油茶粕，水溶性物质茶皂素和可溶性糖均有所降低，分别为3.81%和2.88%，脱皂率高达79%。

2.2 培养基优化

优良的培养基可以为微生物的生长提供所需的全部营养素，包括C源和N源[13]。米曲霉是一类产复合酶的菌株，可使油茶粕中的粗蛋白质、纤维素、糖类物质分解中微生物生长所需的C源和N源，故试验用米曲霉来初步筛选发酵培养基。将米曲霉接种于4种培养基配方中，发酵前后蛋白质含量见图1。

图1 发酵后培养基配方蛋白质含量的变化Fig.1 Changes of protein content of mediums after fermentation

由图1可知，各油茶粕培养基发酵后蛋白质含量均有一定的提高，提高率可达28.00%。其中，以热水脱皂后的油茶粕制备的培养基中蛋白质含量均高于相对应的以未处理的油茶粕制备的，说明油茶粕的茶皂素可以抑制微生物生长；4组培养基配方中，培养基配方Ⅱ的蛋白质提高率较培养基配方Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的大，说明培养基配方Ⅱ的营养成分组成较合理，利于微生物的生长。由此可见，最佳的培养基配方为：热水脱皂的油茶粕16 g，葡萄糖2 g，麦麸1 g，(NH4)2SO41 g，水19 g。

2.3 配伍菌种筛选

混合菌种发酵效果优于单个菌种发酵，因混合菌种发酵可多个菌种之间互相补偿缺陷，进行协同发酵[14-16]。点种各菌株处黑曲霉的生长情况见表3。

表 3 黑曲霉的生长情况†Table 3 Growth conditions of Aspergilluse niger

地衣芽孢杆菌10181、葡萄汁酵母1445与米曲霉可明显刺激黑曲霉生长，因此确定这3种菌为配伍菌种。

2.4 菌种比例及组合优化

2.4.1 双菌种接种比的确定

根据配伍菌种的筛选结果，结合黑曲霉和米曲为同一属的特性，确定地衣芽孢杆菌与黑曲霉为A组，葡萄汁酵母和米曲霉为B组，发酵确定双菌种的接种混合比。

图2 不同比例地衣芽孢杆菌10181与黑曲霉产生粗蛋白含量Fig.2 Protein contents in different ratios of B. licheniformis 10181 and A. niger fermentation

图3 不同比例葡萄汁酵母1445与米曲霉产生粗蛋白含量Fig.3 Protein contents in different ratios of S. uvarum 1445 and A. oryzae fermentation

由图2和图3可知菌组A和菌组B在接种比分别为1：1和1：1时粗蛋白含量最高，因此，接种比为1：1时为双菌种的最佳接种比。

2.4.2 菌组接种比的确定

将菌组A和菌组B按比例接种，发酵，结果见图4。

图4 不同比例组菌A与B菌株组产生粗蛋白含量Fig.4 Protein contents in different ratios of A group and B group fermentation

由图4可知，在菌组A和菌组B的接种比为1︰1时, 粗蛋白含量最高。可得，油茶粕生产蛋白饲料辅料的最佳接种混合比为地衣芽孢杆菌10181︰黑曲霉︰葡萄汁酵母1445︰米曲霉=1︰1︰1︰1。发酵生成的粗蛋白含量为16.94%，较未发酵时的10.82%提高了56.56%。

3 结果与讨论

（1）油茶粕是榨油后的主要副产物，由残油、茶皂素、可溶性糖、蛋白质等有效成分组成，将其高效利用，可以大幅度提高油茶的综合价值。将未经处理的油茶粕和热水脱皂后的油茶粕进行各组成成分测定，两组处理蛋白质含量均为9%以上，并含可溶性糖、纤维素等可被微生物利用的物质，是一种很好的饲料原料。热水脱皂后的油茶粕，脱皂率高达79%，是一种有效的茶皂素提取方式。因此，油茶粕利用微生物法生产蛋白饲料技术与热水提取高纯度、高活性茶皂素技术有机结合以提高油茶粕的利用率可作为下一步研究重点。

（2）优良的培养基可为微生物的生长提供所需的C源、N源等营养素。以米曲霉初步筛选油茶粕发酵培养基，得出最佳配方为：热水脱皂的油茶粕16 g，葡萄糖2 g，麦麸1 g，(NH4)2SO41 g，水19 g。其中，热水脱皂的油茶粕发酵效果优于较未处理的油茶粕的，因油茶粕的茶皂素抑制了微生物生长，在油茶粕利用微生物法生产蛋白饲料前必须进行脱皂素处理。

（3）油茶粕通过多菌种的协同发酵，油茶粕中的多糖、纤维素等物质高效转化成蛋白质。通过平板点种试验，确定与黑曲霉配伍的菌种为：地衣芽孢杆菌10181、葡萄汁酵母1445与米曲霉；根据三角瓶发酵培养，获得了油茶粕发酵产高蛋白的最优菌种组合及发酵比例为地衣芽孢杆菌10181︰黑曲霉︰葡萄汁酵母1445︰米曲霉=1︰1︰1︰1。发酵生成的粗蛋白含量为16.94%，较未发酵时的10.82%提高了56.56%，从而达到了提高产品的粗蛋白含量的目的。

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Protein feed made from optimum culture medium and mixed strains of Camellia meal

MA Li1,2, CHEN Yong-zhong1,2, PENG Shao-feng1,2, WANG Xiang-nan1,2, CHEN Long-sheng1,2, WANG Rui1,2, YANG Xiao-hu1,2, LUO Jian1,2
(1. Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China; 2. National Oil-tea Camellia Engineering &Technology Research Center, Changsha 410004, Hunan, China)

By taking Camellia cake as the raw materials, the screening tests were conducted in order to fi nd out the optimal medium and bacteria group for producing feeding-protein in oil-tea Camellia defatted cake. Firstly, the cake’s composition was analyzed, the results show that the crude protein contents of two groups of cakes were over more than 9%, the cakes are good protein feeds; which contain is a good feed ingredients; then the optimum fermentation medium was obtained by Aspergilluse niger fermentation, the media components is as followings: 16 g Camellia oleifera meal removed SOAP in hot water, 1 g wheat bran, 2 g glucose, 1 g (NH4)2SO4, 19 g water; fi nally, through the plate dibbling test and conical fl ask fermentation, the optimum multi-strains ratio of protein feed was obtained as followings: Bacillus licheniformis 10181: Aspergilluse niger: Saccharomyces uvarum 1445: Aspergillus oryzae, the ratio of them was=1︰1︰1︰1. The crude protein content generated by fermentation under this fermentation condition could reach 16.94%, which was 56.56% higher than that (10.82%) of the control.

Camellia cake; mixed strains; protein feed

S727.3

A

1673-923X(2013)10-0034-04

2013-02-26

“国家油茶工程技术研究中心”（2011FU125X11）的部分研究内容

马 力（1982-），女，湖南湘潭人, 助理研究员，博士研究生，主要从事油茶加工及副产物综合利用研究；

E-mail:supermarry1@163.com

[本文编校：吴 彬]