长白山中华蜜蜂(Apis cerana cerana)遗传多样性分析

于瀛龙，周姝婧，徐新建，朱翔杰，周冰峰

(福建农林大学蜂学学院，福建福州350002)

遗传多样性是物种适应环境变化的必备条件，是进化的物质基础，反映了物种的进化潜力［1］.遗传多样性和遗传结构是种群遗传学、进化生物学和保育遗传学等生命科学的重要内容［1－3］.在我国中华蜜蜂遗传多样性和遗传结构的研究中，云南［4］、福建［5－6］、海南［7］、重庆［8］、广东［9］、华东［10］、东北［11］等地区中华蜜蜂的研究已开展［12－13］.通过19群样本的测定，在长白山中华蜜蜂遗传多样性的研究中已发现了5种mtDNA单倍型种类［11，14－15］;尝试用2群中华蜜蜂样本的csd基因和用12群中华蜜蜂样本的RAPD标记，对长白山中华蜜蜂的遗传多样性和遗传结构进行探索［16－18］.长白山地区中华蜜蜂mtDNA标记、微卫星标记的遗传多样性与遗传结构的分析还需深入研究.

长白山是东北中华蜜蜂的主要分布区，是中华蜜蜂分布的东北部边缘，具有独特的生物学特性［19－20］.长白山中华蜜蜂在长期的进化过程中形成了群势强、耐寒力高、分蜂性弱等适应当地环境的特性［21］，可在最低气温－40℃的环境自然越冬，越冬期长达半年［11，20］.长白山中华蜜蜂在体色、体长、前翅翅脉、肘脉指数等主要形态标记表现出特殊性.相比于其他地区中华蜜蜂，长白山中华蜜蜂个体较大，体色偏黑［21－22］，肘脉指数较高，为 4.09－5.99［21，23－24］，第三径中横脉出现突出的频率较高，为 30%－80%［22，24］.

本研究在长白山的腹地，中华蜜蜂主产区采集110群样本，采用5对微卫星引物和mtDNA tRNAleu-COII 357 bp片段，分析该地区中华蜜蜂的遗传多样性与遗传结构.本研究为长白山地区中华蜜蜂资源保护和利用提供重要理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

中华蜜蜂样本于2008年8月采自吉林省长白山区的安图县池北区、二道白河镇、松江镇地区，总计样本数量110群蜜蜂(表1).

表1 长白山中华蜜蜂样本信息Table 1 Information of samples from Changbai Mountains

1.2 试验方法

每群取1只工蜂，利用UNIQ10柱式基因组DNA抽提试剂盒(生工生物上海股份有限公司)提取基因组.

PCR扩增微卫星位点的引物来源于NCBI网站(表2)，反应条件为95℃预变性5 min;95℃变性50 s，退火30 s(退火温度参照表2)，72℃延伸30 s，30个循环;72℃延伸10 min;4℃保存.微卫星PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.

表2 微卫星位点信息Table 2 Information of 5 microsatellite loci

PCR扩增mtDNA tRNAleu-COII片段，上游引物为E2:5'-GGCAGAATAAGTGCATTG-3'，下游引物H2:5'-CAATATCATTGATGACC-3'［25］.反应条件为95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，30个循环;72℃延伸8 min;8℃保存.mtDNA PCR产物送至上海英骏生物技术有限公司进行测序.为保证结果的准确性，测序结果中个体数量在3只以下的单倍型进行重复测序.

1.3 统计方法

根据8%非变性聚丙烯酰胺电泳结果进行微卫星位点的等位基因判读，利用Ms tools软件计算期望杂合度(expected heterozygosity，He)、观察杂合度(observed heterozygosity，Ho)、多态信息含量(polymorphism information content，PIC)与等位基因频率.利用Popgene 1.31软件计算等位基因数(observed number of alleles，Na)、有效等位基因数(effective number of alleles，Ne)与香农指数(Shannon's information index，I).

mtDNA测序序列以非编码区“AAAATTT”序列为开始，截取357 bp的序列片段进行分析，利用ClustalX 1.83软件对其进行比对，统计单倍型种类，利用MEGA 4.0软件计算序列的碱基组成，利用DnaSP 5.00.07软件计算单倍型多样度(haplotype diversity，Hd)，核苷酸多样度(nucleotide diversity，Pi)与平均核苷酸差异数(average number of nucleotide differences，K).

2 结果与分析

2.1 长白山中华蜜蜂遗传多样性

2.1.1 微卫星位点的遗传多样性 长白山中华蜜蜂在A107、AP043、AP085、AP313、AT101位点整体等位基因较少，遗传多样性水平低.每个微卫星位点发现1－4个等位基因，平均等位基因数为2.6000±1.1402，平均有效等位基因数为1.4181±0.6487.长白山中华蜜蜂5个微卫星位点的期望杂合度为0－0.6107，平均期望杂合度为0.2110±0.2333.除A107位点的期望杂合度为0.6107外，其余4个位点的期望杂合度为0－0.1780.5 个位点的观察杂合度为0－0.1827，平均观察杂合度为0.0645 ±0.0718.5 个位点的平均香农指数为 0.4031 ±0.4202(表3).

表3 长白山中华蜜蜂微卫星DNA的遗传多样性参数Table 3 Genetic diversity parameters of Apis cerana cerana from Changbai Mountains by microsatellite loci

2.1.2 线粒体DNA遗传多样性 长白山中华蜜蜂在mtDNA tRNAleu-COII 357 bp片段T、C、A、G 4种核苷酸的平均比例分别为44.8%、9.5%、40.6%和5.0%.长白山中华蜜蜂共检测出9种单倍型，H1单倍型(Japan1型，AB078733)是文献报道中分布较为广泛的类型，相比于H1单倍型，1种单倍型在1个位点上发生缺失，7种单倍型分别在1个位点发生突变(表4)，其中单一多态位点4个，简约信息位点3个.

表4 长白山中华蜜蜂mtDNA tRNAleu-COII片段单倍型种类及变异信息1)Table 4 Variable sites and haplotypes of Apis cerana cerana from Changbai Mountains in mtDNA tRNAleu-COII region

长白山中华蜜蜂mtDNA tRNAleu-COII 357 bp片段遗传多样性偏低，单倍型多样度为0.249±0.054、核苷酸多样度为0.00074 ±0.00017、平均核苷酸差异为0.263.

本研究在长白山地区新发现 H2、H3、H4、H5、H7、H8、H9等7种单倍型.与 NCBI网站进行比对，H3(登录号:KF673779)、H5(登录号:KF673782)、H7(登录号:KF673780)、H8(登录号:KF673781)等4种单倍型为中华蜜蜂中首次发现(表4)，H2、H4、H9等3种单倍型为在长白山地区发现的新记录.

2.2 长白山中华蜜蜂遗传结构

2.2.1 微卫星遗传结构 长白山中华蜜蜂5个微卫星位点的遗传结构中，均以一种等位基因为主.AP043、AP085、AP313、AT101等4个位点的主要主等位基因，占所检测到的等位基因90%以上.AP313位点只有1种等位基因(342 bp).A107有4种等位基因，其中165 bp占所检测到的等位基因50%以上(表5).2.2.2 线粒体遗传结构 长白山中华蜜蜂mtDNA tRNAleu-COII 357 bp片段的遗传结构较单一.9种单倍型中，以H1(Japan1型)单倍型为主，占83.64%.其次为H9单倍型，占6.36%.其余7种单倍型频率为0.91%－2.73%(表 4).

表5 长白山中华蜜蜂的微卫星遗传结构Table 5 Genetic structure of Apis cerana cerana based on microsatellite in Changbai Mountains

3 讨论

(1)在现有中华蜜蜂遗传多样性研究中，中华蜜蜂 A107、AP043、AP085、AP313、AT101 这 5 个微卫星位点的 PIC 值主要范围分别是0.5－0.6、0.2－0.5、0.7－0.85、0.2－0.4 和 0.2－0.5［5－6，26］，长白山中华蜜蜂的 PIC 值分别为 0.5541、0.1186、0.1319、0和0.1644，均低于PIC值的主要分布范围或处于较低水平.期望杂合度也体现出相似的规律［5－6，26］.目前，较少使用mtDNA tRNAleu-COII片段进行中华蜜蜂遗传多样性研究，仅有海南中华蜜蜂的相关研究中运用了该片段.海南中华蜜蜂 mtDNA tRNAleu-COII片段发现单倍型多样度、核苷酸多样度、平均核苷 酸 差异分别为 0.742 ± 0.017、0.00354 ±0.00013和1.248［7］，而长白山中华蜜蜂的这3个指标均远低于海南中华蜜蜂的研究结果.所以微卫星和线粒体分子遗传标记分析，均说明长白山中华蜜蜂遗传多样性水平处于非常低的水平.

(2)长白山植被良好、具有大宗蜜源以及丰富的辅助蜜粉源，是中华蜜蜂优良的栖息地.20世纪前长白山野生中华蜜蜂资源极丰富，此地蜂蜜是皇家贡品［27］.由于西方蜜蜂引进后引起种间竞争，导致长白山中华蜜蜂种群数量下降;外来中华蜜蜂基因渗入，使得当地中华蜜蜂面对环境变化、疾病等恶劣条件的耐受性下降;经济较发达的邻国对野生蜂蜜的高价需求，促进毁巢取蜜的行为，毁灭性减少了当地野生中华蜜蜂的种群数量;社会经济的发展，养蜂人的数量减少，养蜂技术下降;人工育王技术应用不当，以上原因均使得长白山中华蜜蜂种群遗传多样性降低.长白山中华蜜蜂形成分散的小种群，遗传变异低于其它地区的中华蜜蜂，并表现出较为单一的遗传结构.

(3)长白山中华蜜蜂是分布在我国东北地区的中华蜜蜂代表，是耐寒型中华蜜蜂的宝贵资源.原长白山中华蜜蜂广泛分布在黑龙江省的小兴安岭以南、吉林省和辽宁省的长白山脉，具有维持强群、耐寒力强等优良蜂种特性.但近年来长白山中华蜜蜂数量大幅度减少，已成为中华蜜蜂中数量最少的生态型，处于濒危维持状态［9，28］.长白山中华蜜蜂存在着灭绝的风险.生命资源的灭绝将会永久消失，因此抢救性保护长白山中华蜜蜂刻不容缓.建议在长白山中华蜜蜂分布较多、生态条件较好的地方设立中华蜜蜂保护区;在保护区内政府用补贴、技术支持等形式鼓励当地农民原始饲养本土的中华蜜蜂，扩大长白山中华蜜蜂的种群数量;禁止西方蜜蜂和转地的中华蜜蜂进入，禁止从保护区外购买蜂种或蜂王，保持长白山中华蜜蜂的遗传特征;在保护区内适当的有计划的蜂群交流，不进行人工选育，保持长白山中华蜜蜂的遗传多样性.致谢:样本采集中得到了杨明福等同志的帮助.本科生夏凤枝参与部分实验.谨此致谢!

［1］法兰克汉，巴卢，布里斯科.保育遗传学导论［M］.北京:科学出版社，2005:30.

［2］沈银柱，黄占景，王正询，等.进化生物学［M］.北京:高等教育出版社，2008:112－113.

［3］徐晋麟，赵耕春.基础遗传学［M］.北京:高等教育出版社，2009:282－284.

［4］殷玲，吉挺，陈国宏.利用微卫星标记分析云南省6个东方蜜蜂(Apis cerena)群体遗传多样性及遗传分化［J］.西南农业学报，2011，24(2):772－778.

［5］朱翔杰，徐新建，周妹婧，等.武夷山自然保护区中华蜜蜂微卫星DNA遗传分析［J］.福建农业学报，2011，26(6):935－940.

［6］朱翔杰，周冰峰，吴显达，等.福建中华蜜蜂微卫星标记的遗传多样性分析［J］.福建农林大学学报:自然科学版，2011，40(4):407－411.

［7］周姝婧，徐新建，朱翔杰，等.海南中华蜜蜂线粒体DNA的遗传多样性［J］.福建农林大学学报:自然科学版，2012，41(2):170－175.

［8］曹联飞，姬聪慧，任勤，等.重庆金佛山地区东方蜜蜂遗传多样性研究［J］.西南师范大学学报，2010，35(5):162－166.

［9］成纯富，周丹银，刘意秋，等.基于mtDNA Cytb基因序列分析广东省东方蜜蜂遗传多样性［J］.蜜蜂杂志，2012(9):4－6.

［10］吉挺，殷玲，刘敏，等.华东地区中华蜜蜂六地理种群的遗传多样性及遗传分化［J］.昆虫学报，2009，52(4):413－419.

［11］李志勇，薛运波，赵惠燕.长白山区中华蜜蜂mtDNA非编码区至COⅠ基因PCR及序列分析［J］.湖北农业科学，2009，48(5):1051－1054.

［12］YIN L，JI T，LIU M，et al.Genetic diversity and relationship between genetic distance and geographical distance of 6 Apis cerana cerana populations in China［J］.Research Journal of Animal Sciences，2008，2(6):183－187.

［13］SMITH D R，VILLAFUERTE L，OTIS G，et al.Biogeography of Apis cerana F.and A.nigrocincta:insight from mtDNA studies［J］.Apidologie，2000，31(2):265－279.

［14］TAN K，WARRIT N，SMITH D R.Mitochondrial DNA diversity of Chinese Apis cerana［J］.Apidologie，2007，38(3):238－246.

［15］姜玉锁，赵慧婷，姜俊兵，等.中国境内不同地理型东方蜜蜂线粒体tRNAleu-COII基因多态性研究［J］.中国农业科学，2007，40(7):1532－1542.

［16］刘志勇，王子龙，王欢，等.中华蜜蜂csd多态性分析［J］.中国农业科学，2011，44(23):4911－4917.

［17］薛运波，李兴安，葛凤晨，等.长白山中华蜜蜂基因组DNA多态性的研究［J］.中国农业科学，2007(40):426－432.

［18］薛运波，李兴安，葛凤展，等.长白山中华蜜蜂基因组CBS-700(bp)DNA同源片段克隆及其Southern杂交的研究［J］.中国蜂业，2006，57(10):8－11，17.

［19］杨冠煌.中华蜜蜂［M］.北京:中国农业科技出版社，2001:13.

［20］龚一飞，张其康.蜜蜂分类与进化［M］.福建:科学技术出版社，2000:21.

［21］杨冠煌，李桂仙.中华蜜蜂分布和变异(五)—东北地区中华蜜蜂资源［J］.中国养蜂，1983(5):19.

［22］杨冠煌，许少玉，匡邦郁，等.东方蜜蜂Apis cerana Fab在我国的分布及其亚种分化［J］.云南农业大学学报，1986，12(1):89－92.

［23］张连江，樊贤，谭垦，等.长白山东方蜜蜂形态特征研究［J］.云南农业大学学报，2006，21(4):511－516.

［24］葛凤晨，历延芳，柏建民，等.长白山中华蜜蜂分布及其生产效率的研究［J］.中国养蜂，2002，53(6):4－7.

［25］GARNERY L，COMUET J M，SOLIGANAC M.Evolutionary history of the honey bee Apis mellifera inferred from mitochondrial DNA analysis［J］.Moleculor Ecology，1992，1(3):145－154.

［26］徐新建，周姝婧，朱翔杰，等.海南岛中华蜜蜂遗传多样性的微卫星DNA分析［J］.昆虫学报，2013，56(5):554－560.

［27］葛凤晨，陈东海，历延芳，等.长白蜜蜂文化研究［M］.长春:吉林科学技术出版社，2006:1－21.

［28］国家畜禽遗传资源委员.中国畜禽遗传资源志:蜜蜂志［M］.北京:中国农业出版社，2011:45－49.