水稻条纹病毒编码的NS2蛋白的亚细胞定位分析

郑璐平，林 辰，吴祖建，谢联辉

(福建农林大学植物病毒研究所，福建福州350002)

水稻条纹叶枯病是水稻上的重要病害之一，是由水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RSV)引起的一种病毒病.1975年日本首次发现并报道该病毒［1］，随后在中国、韩国等水稻种植区也相继发现该病毒.RSV属于极纤细病毒属，由介体昆虫灰飞虱持续传播，并可经卵传播［2］.发病水稻心叶出现褪绿黄白斑，而后扩展成与叶脉平行的黄色条纹，条纹间仍保持绿色，其茎秆有时出现褪绿现象，能引起水稻抽穗畸形、枯心，结实少甚至不结实，给水稻产量造成严重影响［3－4］.

RSV病毒粒子为线状，长为500－2000 nm，直径为3－8 nm，由4个基因组组成(RNA1、RNA2、RNA3和RNA4)，该病毒共编码7个蛋白［5］，除RNA1为负义编码方式外，其他基因组均采用双义编码方式.RNA1编码的蛋白大小为337 kD，具有依赖RNA的RNA聚合酶(RNA－dependent RNA polymerase，RdRp)功能［6］;RNA2编码2个蛋白，其正义链编码NS2蛋白，大小为22.8 kD，该蛋白被鉴定为弱沉默抑制子，并能与水稻内源基因SGS3互作［7］，负义链编码大小为94 kD的NSc2蛋白，该蛋白可能是一个膜糖蛋白［8］;RNA3编码一个沉默抑制子NS3［9］和一个核衣壳蛋白NSc3(即CP)［10］;RNA4编码一个病害特异性蛋白SP 以及一个运动蛋白 Nsvc4［11－12］.

细胞的大多数遗传物质都存在于细胞核中，用于维持基因完整性，调节基因表现，并借此来影响细胞活动［13－14］.细胞核被认为是 RNA 沉默发生的起点［15］，因此，很多病毒编码的沉默抑制子如 RSV NS3［9］、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)2b蛋白、马铃薯A病毒(Potato virus A，PVA)VPg蛋白均定位于细胞核［16－17］.笔者对RSV NS2初期研究发现，该蛋白同样定位于细胞核，并形成大小不一的小点，推测其可能与柯浩体(cajal body，CB)共定位.因此，本文将进一步研究RSV NS2的亚细胞定位，以期为深入研究NS2的功能奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 RSV水稻病株、拟南芥以及本氏烟为本实验室保存.水稻病株种植在温室中，拟南芥和本氏烟分别种植在温度为22和25℃的人工气候培养箱中(16 h/光，8 h/暗).

1.1.2 菌种和载体 入门载体pDNOR221、表达载体pEarley101和pEarley102由加拿大农业部王爱民博士赠送，表达载体35S－GFP、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株由本实验室保存.

1.1.3 试剂 RNA提取试剂盒(EasyPure Plant RNA Kit)、Taq酶(TransStart TopTaq DNA Polymerase)、质粒提取试剂盒(EasyPure HiPure Plasmid MaxiPrep Kit)和DNA回收试剂盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)购于北京全式金生物技术有限公司;反转录试剂盒(FastQuant RT Kit with gDNase)购于北京天根生化科技有限公司;限制性内切酶MluⅠ购于宝生物工程(大连)有限公司;BP ClonaseTMⅡ Enzyme Mix和LR ClonaseTMⅡEnzyme Mix购于invitrogen公司.引物合成、序列测定和绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)多克隆抗体制备由南京金斯瑞生物科技有限公司完成.碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG购于Sigma公司，BCIP/NBT显色试剂盒购于成都贝斯特试剂有限公司.

1.2 方法

1.2.1 NS2及CB蛋白(coilin)cDNA开放阅读框(open reading frame，ORF)的克隆 分别取0.1 g本氏烟和水稻叶片，迅速放入液氮中，按试剂盒说明书完成RNA提取.根据GenBank中报道的RSV NS2(Gen－Bank accession:EF493228)和Atcoilin(GenBank accession:NM_101173)设计引物(表1)，以RNA反转录产物cDNA第一链为模板进行PCR扩增.反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35个循环;最后72℃终延伸10 min.扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的条带.按BP ClonaseTMⅡEnzyme Mix说明书操作，将回收条带与入门载体pDNOR221进行同源重组，并将重组产物转化到DH5α中，经卡那霉素抗性平板筛选培养，挑选单菌落摇菌并提取质粒，经MluⅠ酶切鉴定正确后，委托南京金斯瑞生物技术有限公司测序.

表1 本研究所用引物1)Table 1 Primers used in this study

1.2.2 植物重组表达载体pEarley102－NS2、pEarley101－coilin的构建 将测序正确的质粒pDNOR221－NS2和pDNOR221－coilin进行MluⅠ单酶切，分别回收目的条带.根据LR ClonaseTMⅡEnzyme Mix说明书操作，将回收条带分别与pEarley102、pEarley101同源重组后转化到DH5α中，经卡那霉素抗性平板筛选培养，挑取单菌落摇菌并提取质粒;将PCR鉴定正确的重组质粒通过液氮冻融法转化到EHA105中，再经卡那霉素和利福平抗性平板筛选培养，挑取单菌落进行PCR鉴定.

1.2.3 本氏烟总蛋白提取及Western blot检测 取接种后3 d的本氏烟叶片0.3 g(未接种的健康植株为对照)，加入 1 mL 蛋白提取蛋白缓冲液(50 mmol·L－1phosphate pH 8.0，10 mmol·L－1Tris pH 8.0，500 mmol·L－1NaCl，0.1%Tween 20，0.1% β－巯基乙醇，1 mmol·L－1PMSF，Roche Protease inhibitor cocktail MINI tablet 10 mL·片－1).研磨数分钟，移入1.5 mL 离心管，4 ℃、12000 r·min－1离心 10 min，吸取上清液至新离心管中，4℃、12000 r·min－1离心10 min，吸取上清液至新离心管中，完成总蛋白的提取.

取适量提纯的蛋白与5×SDS－PAGE loading buffer混匀后，98℃煮沸5 min，在12%SDS－PAGE上电泳.电泳结束前20 min，将PVDF膜在甲醇中浸润10 s后，转移至电转缓冲液中浸润20 min，待电泳结束后，将凝胶转移到膜上，通过湿转转膜仪转膜(80 V，45 min).转膜结束后，取出PVDF膜，用1×PBST清洗3次(5 min·次－1)，加入封闭液，37℃、50 r·min－1震荡1 h，用1×PBST清洗膜3次;加入GFP抗体孵育(37 ℃、50 r·min－1、1 h)，再用1 ×PBST 清洗膜3 次;加入二抗(羊抗兔)孵育(37 ℃、50 r·min－1、1 h)，用1×PBST清洗膜3次.参照BCIP/NBT显色试剂盒，在AP碱性磷酸反应缓冲液中加入等量底物显色溶液BCIP/NBT避光显色(10－20 min).

1.2.4 NS2在本氏烟表皮细胞中的定位观察 将NS2－CFP(EHA105)和coilin－YFP(EHA105)于28℃下，在含有0.05 mg·L－1卡那霉素和0.05 mg·L－1利福平的LB液体培养基中培养至对数生长期.取1 mL菌液于 12000 r·min－1离心 1 min，弃菌液，底部菌体用悬浮液(10 mmol·L－1MES pH 5.6，10 mmol·L－1MgCl2和150 μmol·L－1乙酰丁香酮)悬浮2次后，用悬浮液调整菌液浓度至D600nm≈0.7，将两者按体积比1∶1混合，室温放置3 h.用1 mL注射器吸取适量菌液，用无针头的针管将菌液慢慢注入本氏烟叶片背部组织的空隙中，浸润接种的植株于25℃暗培养，48 h后在激光共聚焦显微镜(Microsystems CMS GmbH Leica TCS SP5)下观察融合蛋白的亚细胞定位结果.

2 结果与分析

2.1 RSV NS2和Atcoilin的cDNA的克隆及其表达载体的构建

通过RT－PCR方法从水稻和拟南芥RNA反转录的cDNA中扩增到大小分别为600和1800 bp的条带(图1)，与目的条带大小一致;回收这2个片段，分别与入门载体pDNOR221进行同源重组，将重组质粒进行MluⅠ单酶切，出现大小为900 bp的条带，与预期一致，并通过测序确定重组质粒的正确性，将正确的质粒分别命名为pDNOR221－NS2和 pDNOR221－coilin(图2).回收图2酶切产物2400和3600 bp的条带，将其分别与表达载体pEarley102和pEarley101同源重组，经PCR扩增鉴定(图3)，重组质粒条带大小与预期一致;将正确的质粒转化到农杆菌EHA105中，并进行单菌落PCR鉴定(图3)，条带大小与目的基因一致，说明重组质粒成功转化到EHA105.

图1 RSV NS2及Atcoilin基因的扩增Fig.1 Amplification of RSV NS2 and Atcoilin

图2 重组质粒单酶切鉴定图Fig.2 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

图3 重组植物表达载体的PCR鉴定Fig.3 Identification of recombinant expression vectors by PCR

2.2 Western blot检测蛋白的表达

以GFP多克隆抗体为一抗、碱性磷酸酶标记的羊抗兔为二抗检测本氏烟叶片中GFP、YFP和CFP的表达.图4显示，仅接种GFP的本氏烟，约在30 kD处有一明显条带，与GFP大小一致;接种NS2－CFP和coilin－YFP的本氏烟，分别在53和130 kD处有明显条带，与融合后重组蛋白的分子质量大小一致;健康植株则未出现特异条带，说明本氏烟叶片中检测到的蛋白条带是由外源蛋白特异表达，且这些蛋白的表达是正确的.

2.3 RSV NS2和Atcoilin在本氏烟叶片表皮细胞中的定位

取接种48 h的本氏烟叶片在激光共聚焦显微镜下观察，NS2－CFP与Atcoilin－YFP共定位(图5)，说明NS2定位在CB上.

图5 NS2与coilin的亚细胞定位Fig.5 Subcellular localization of fusion protein NS2 and coilin

图4 本氏烟叶片中蛋白表达情况的Western blot检测Fig.4 Western blot analysis of proteins expression in Nicotiana benthamiana leaves

3 讨论

本研究利用模式植物本氏烟，结合农杆菌接种法观察RSV NS2的亚细胞定位，发现该蛋白定位在细胞核的CB上.试验过程中还发现，在进行农杆菌接种时，菌液的浓度不可太高，否则易损伤叶片，使外源蛋白无法表达.而蛋白在本氏烟表皮细胞瞬时表达的时间因蛋白而异，尤其研究对象CB是一个动态结构，并非在所有的细胞中都能看到该结构，CB的大小、数量与细胞环境、细胞核内小核核糖体蛋白(small nuclear ribonucleoprotein，snRNP)组装水平和RNA合成效率相关［18－19］.因此，在接种期间要定时观察，以找到最适宜观察的时间点.

CB是细胞核中一个重要的细胞器.Kim et al［20］研究发现，花生丛簇病毒(Groundnut rosette virus，GRV)编码的ORF3蛋白定位在CB上，其借助CB进入核仁，并由此与核仁蛋白fibrillarin(Fib)互作，从而完成病毒的侵染过程，在此过程中病毒蛋白和Fib缺一不可［21］.Fib是核仁和CB的指示蛋白，定位在核仁和CB上.一些病毒可通过招募细胞的核蛋白进行病毒核糖核蛋白粒子的装配、病毒的复制和移动等［22］，如水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus，RDV)编码的Pns11与Fib互作［23］，动物病毒如甲型流感H3N2病毒也与Fib蛋白互作［24］.另外，在利用RNAi技术沉默RSV不同编码蛋白基因的研究中发现，针对RSV NS2沉默的转基因水稻表现出一定的抗性，故研究者推测该蛋白可能参与病毒的增殖［25］.根据本研究结果，RSV NS2与CB共定位，可能发生直接或间接的互作，这一互作是否介导病毒的复制和增殖，将成为今后的研究重点.

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