绿茶汤中主要化学物质与色泽劣变的相关性研究

李云飞，戴前颖*，夏涛，高丽萍，孟 菲

（1.安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部重点实验室，合肥230036；2.安徽农业大学生命科学学院，合肥230036）

优质绿茶饮料汤色黄绿明亮，然而受光照、氧气、温度影响，绿茶饮料逐渐变黄、变红，甚至变褐，发生色泽劣变现象，影响产品的货架期和外观质量。近年来，越来越多的国内外茶叶工作者开始尝试用数理分析解释内含物与感官品质的关系。Kunbo Wang等通过对龙井、乌龙进行外观审评，将得到的分数与儿茶素、叶绿素、挥发性物质、氨基酸进行相关性分析，结果表明，龙井茶汤的色泽分数与叶绿素a和叶绿素b极显著相关，与EGC显著相关(r=0.499，P<0.01)。乌龙茶汤的色泽分数与总儿茶素、EGC、C和游离氨基酸显著相关 (r=0.384～0.965,P<0.01)[1，2]。徐文平选取咖啡碱、EGCG以及芦丁作为研究对象，与感官审评中得到的苦涩味强度进行相关性分析[3]。龚淑英等分析了普洱在贮藏期间茶多酚、可溶性糖、氨基酸含量的变化与感官品质的相关性[4]。

然而多数研究均是基于感官审评，而感官审评既受环境因素制约，更受评审人员审评条件和阅历的影响，因此无法完全做到标准化和客观性。色差计是一种更加客观与科学的颜色测量仪器，陆建良对29个绿茶、20个乌龙茶和15个红茶样品进行了色差参数分析和感官审评。结果表明，茶类间色差参数差异显著，并与感官评分具有相关性[5]。李立祥研究得出了相似结果并认为色差的衍生指标a/b可以在很大程度上反映绿茶汤色的优劣[6]。

本文利用色差计检测了5种绿茶茶汤在40℃贮藏12 d的条件下色泽变化，并跟踪检测了其主要内含物成分变化，利用SPSS软件对各主要化学成分与色差参数进行了相关性分析，研究茶汤在贮藏过程中，化学成分变化与汤色劣变的关系。从而对揭示茶汤色泽的变化规律，选择合理的护色方案，完善绿茶饮料加工工艺具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂与仪器

试验材料：绿茶炒青、瓜片、黄芽、毛峰、龙井购自安徽农业大学茶厂。茶叶用粉碎机粉碎，过100目筛网后，作为供试茶样。

试剂配制：

（1）pH8.0磷酸盐缓冲液：配制1/15mol/L磷酸氢二钠和1/15mol/L磷酸二氢钾溶液。然后取1/15 mol/L的磷酸氢二钠溶液95mL和1/15mol/L磷酸二氢钾溶液5mL，混匀。

（2）2%茚三酮溶液：称取水合茚二酮（纯度不低于99%）2 g，加50mL水和80mg氯化亚锡（SnCl·2H2O）搅拌均匀。分次加少量水溶解，放在暗处，静置一昼夜，过滤后加水定容至100mL。

（3）蒽酮：称取100mg蒽酮溶于100mL 98%硫酸溶液中，用时配制。

超纯水为杭州娃哈哈饮用水。实验用的甲醇、乙腈和乙酸为色谱级的试剂，购于Tedia公司（USA）。

主要仪器：日本SHIMADZULC-20AD高效液相色谱仪、SPD6AV可调波长紫外检测器（日本岛津公司）、LC-solution色谱工作站、UV-2800型紫外可见分光光度计 (上海尤尼柯仪器有限公司)、Minolta CM-3500D型色彩色差仪（日本柯尼卡美能达公司）。

1.2 试验方法

茶汤的制备：将供试茶样按1.0 g:100mL茶水比于85℃水浴中提取15min，期间搅拌数次。茶汤冷却后，用定量滤纸抽滤，700W微波杀菌3min[7]，置于40℃培养箱，每3 d检测色差和总糖、游离氨基酸、儿茶素、咖啡碱、黄酮醇含量。

总糖总量：蒽酮比色法[8]。

游离氨基酸含量检测：茚三酮比色法[9]。

儿茶素含量检测:利用岛津LC-20AD高效液相色谱仪（HPLC，配SPD-M20A二极管阵列检测器），检测条件为：phe-nomenex-C18(300mm×4.60mm)柱，流动相A相：1%乙酸水溶液，B相：100%乙腈。洗脱梯度为：20min内A相从90%降到87%，B相从10%升到13%；20～40min内A相从87%降到70%，B相从13%升到30%；40～55min内A相从70%升到90%，B相从30%降到10%。流速：1mL/min，柱温：30℃，检测波长280nm，每次进样量20μL，保留时间90min.

咖啡碱含量检测：方法同儿茶素检测方法。

黄酮醇含量检测：方法同儿茶素检测方法，检测波长为345nm。

色差检测方法：采用Minolta CM-3500D型色差仪，对处理样品的色度值L、a、b进行测定。

茶汤中黄酮醇类化合物的定性检测，LC/ESI-TOF-MS条件，离子化模式为大气压电喷雾离子源（ESI）；负离子模式；源电压3.5 kV；碰撞电压:15～20V；壳气 50psi；氮气流速 12mL/min；加热细管温度300℃；流速:0.4mL/min；检测波长:345 nm。

数据分析及统计：本文利用SPSS 18.0对实验结果进行统计学分析，研究色差参数与主要化学组分之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 贮藏期间茶汤色差参数的变化

表1系5种茶汤的色差参数变化，在0d时，所有茶汤明亮度相似；瓜片、黄芽绿度最好，毛峰与龙井次之，炒青较差；黄度方面瓜片、龙井最大，毛峰和炒青次之，黄芽较低。在储存的过程中，茶汤的L值随着贮藏天数的增加不断下降，到12d时下降了34%～43%；a、b值不断上升，在感官上表现为明亮度下降，浑浊度上升，茶汤的色泽变红，变褐。

2.2 贮藏期间茶汤化学成分变化

2.2.1 贮藏期间氨基酸和总糖的变化

氨基酸与糖类物质被认为在一定温度下会发生非酶褐变，生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精或称拟黑素[10]，研究两者含量变化对辨别茶饮料在贮藏过程中美拉德反应对茶汤色泽的影响有着重要作用。表2、表3分别为储存期茶汤中氨基酸和总糖含量的变化。从表中可以看出，茶汤中氨基酸在储存期间有先上升再下降的趋势，这可能是随着贮藏时间的延长，在氨基酸氧化、降解的同时，有部分水溶性蛋白质水解成氨基酸所致[11]；而总糖变化幅度则不是很明显，趋势也不是很清晰。

表1 各种茶汤在贮藏过程中的色差参数

2.2.2 贮藏期间咖啡碱和儿茶素的变化

表2 茶汤氨基酸含量变化 （mg/mL）

虽然儿茶素本身无色，不是茶汤的呈色物质，但儿茶素的转化产物可能会对茶汤色泽劣变产生影响。儿茶素易氧化、聚合、缩合，在空气中可以自动氧化成黄棕色物质[12]。图1为0d时五种茶汤咖啡碱以及儿茶素HPLC图谱。将检测出儿茶素和咖啡碱含量变化列于表4。可以发现表型儿茶素在贮藏的过程中下降明显，而非表型儿茶素由于在发生氧化及脱没食子酸反应的同时[13]，表型儿茶素还会发生异构化反应生成非表型儿茶素[14]，在贮藏过程中会出现增加的现象。

表3 储存期茶汤总糖含量变化（mg/mL）

表4 储存期茶汤中咖啡碱与儿茶素含量变化（峰面积）

表5 主要黄酮醇类化合物的光谱特征和分子量

表6 储存期茶汤中黄酮醇类物质含量变化 （峰面积）

2.2.3 贮藏期间黄酮醇类物质的变化

黄酮醇在茶叶中多与糖形成黄酮醇苷类物质，占茶叶干重的3%～4%，多为亮黄色，其氧化产物为橙黄以致棕红，与绿茶汤色关系较大[15]。茶汤中的黄酮醇类化合物的种类很多[16]，目前尚无法准确定量茶汤中的黄酮醇类化合物。本实验室参考Lin L.Z的方法，采用液相质谱（LC/ESI-TOF-MS）结合现有标准品进行定性[17]，对茶汤中黄酮醇类化合物进行分析，分离检测到10个黄酮醇苷的物质峰（图2），并鉴定出8个峰，分别为杨梅素、槲皮素、山奈素的糖苷类化合物，如表5所示。

表6为储存期茶汤中黄酮醇类物质含量变化，从表中可以看出不同茶汤黄酮醇类物质起始值差别很大，瓜片和毛峰的黄酮醇类物质含量较大，而炒青和龙井黄酮醇类物质含量较少[18]。

在储存期间，黄酮醇类物质变化区别较大，峰1、2变化趋势不明显，峰 3、4、9、10出现下降，而其它峰有先增加再下降的趋势。其中，黄酮醇单糖苷变化速度较快（峰3、4），而黄酮醇三糖苷由于配糖化作用，反应速度较慢[19]。

2.3 相关分析

利用SPSS 18.0对实验结果进行统计学分析，研究色差参数与茶汤主要化学组分之间的相关性，结果列于表7，结果表明，儿茶素类如EGCG、EC、C、GCG、ECG与色泽相关性十分显著，特别是EGCG与明亮度（L）、红绿度（a）、黄度（b）、a/b值均存在极其显著相关性；此外黄酮醇单糖苷（峰3杨梅素半乳糖糖苷，峰4杨梅素葡萄糖苷）与L值、红绿度（a）、a/b均极显著相关；而其他黄酮醇类化合物以及氨基酸、总糖、咖啡碱与色差参数相关性则不明显。表明茶汤在贮藏期间，儿茶素和黄酮醇单糖苷是影响茶汤劣变的重要指标。

表7 茶汤主要化学组分与色差参数的相关性

3 结论与讨论

茶饮料是一种高浓度溶液，化学成分繁多，反应体系复杂，在贮藏过程中化学物质对茶饮料的色泽产生影响既有独立影响，也有共同影响。近年来茶叶工作者普遍认为茶汤色泽与儿茶素、黄酮醇类化合物以及美拉德反应联系紧密。但是从本文得到的结果来看，茶汤中氨基酸与总糖含量的变化与色泽并无明显的相关性，说明茶汤在40℃下贮藏，美拉德反应并不是茶汤色泽劣变的主要因素；而儿茶素特别是EGCG与茶汤色泽极显著相关，佐证了儿茶素聚合氧化，会对茶汤色泽产生重要影响。此外两个杨梅素单糖苷与色泽也有着极显著的相关性，进一步证实了朱博的观点：贮藏期绿茶茶汤的三个主要黄酮醇（杨梅素、槲皮素、山萘素）都与色泽有一定的相关性，杨梅素苷类与绿茶茶汤色泽的关系最密切[20]。

综上所述，本实验结果表明绿茶在储存期间，儿茶素和黄酮醇类化合物与色泽关系紧密，为下一步研究其劣变机理打下了基础，确定了方向。但是必须认识到，茶饮料组分复杂，本文仅选取几种主要研究热点的组分进行分析，不能完全揭示和解释茶饮料劣变的原因，以及儿茶素在茶饮料这个复杂体系中氧化的机理，是否与其他物质发生协同影响，这都是需要进一步研究的。

[1]Wang K B,.Ruan JY.Analysis of chemical components in green tea in relationwith perceived quality,a case studywith Longjing teas[J].International Journalof Food Science and Technology,2009,44(12):2476～2484.

[2]Kunbo Wang,Fang Liu,Zhong Liu,etal.Analysis of chemical components in oolong tea in relation to perceived quality[J].International Journalof Food Scienceand Technology,2010,45(5):913～920.

[3]徐文平,李大祥,张正竹,等.绿茶几种化学组分苦涩味非线性回归分析及在感官审评中的应用[J].茶叶科学,2010,30(5):399～406.

[4]龚淑英,周树红.普洱茶贮藏过程中主要化学成分含量及感官品质变化的研究[J].茶叶科学,2002,22(1):51～56.

[5]陆建良,梁月荣,龚淑英,等.茶汤色差与茶叶感官品质相关性研究[J].茶叶科学,2002,22(1):57～61.

[6]李立祥,梅玉,常珊,等.绿茶汤色分析[J].食品与发酵工业,2005,31(10):123～126.

[7]宁井铭,方世辉,夏涛,等.绿茶饮料微波灭菌技术研究[J].安徽农业大学学报,2005,32(3):365～368.

[8]周向军,高义霞,李娟娟,等.蒽酮-硫酸比色法测定乌龙茶多糖的条件研究[J].中国食品工业,2011,(8):54～56.

[9]邵金良,黎其万,董宝生,等.茚三酮比色法测定茶叶中游离氨基酸总量[J].中国食品添加剂,2008,(2):162～165.

[10]郑文华,许旭.美拉德反应的研究进展[J].化学进展,2005,17(1):122～129.

[11]肖文军,胡详文,龚志华,等.优质绿茶贮藏过程品质劣变的研究[J].天然产物研究与开发,2006,18(6):999～1002,1047.

[12]李大祥,宛晓春,杨昌军,等.茶儿茶素氧化机理[J].天然产物研究与开发,2006,18(1):171～181.

[13]Jin Ze Xu,Lai Kwok Leung,Yu Huang,et al.Epimerisation of tea polyphenols in tea drinks[J].Journalof the Scienceof Food and Agriculture,2003,83(15):1617～1621.

[14]Zhen-Yu Chen,Qin Yan Zhu,David Tsang,etal.Degradation ofgreen tea catechins in tea drinks[J].JournalofAgriculturaland Food Chemistry,2001,49(1):477～482.

[15]钟萝.茶叶品质理化分析[M].上海:上海科学技术出版社,1989:85～89.

[16]卢邦俊.高效液相色谱法测定茶叶中的黄酮醇[D].四川:成都理工大学,2006.

[17]Lin LZ,Chen P,Harnly JM.New phenolic componentsand chromatographic profilesof green and fermented teas[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(17):8130～8140.

[18]宛晓春.茶叶生物化学[M].北京:中国农业出版社,2003:108.

[19]Finger A.In vitrostudieson theeffectofpolyphenoloxidaseand peroxidaseon the formation ofpolyphenolic black tea constituents[J].Journal of the Scienceof Food and Agriculture,1994,66(3):293～305.

[20]朱博,夏涛,高丽萍,等.绿茶茶汤中黄酮醇及其苷类的测定方法以及对茶汤色度的影响[J].食品与发酵工业,2009,35(2):146～150.