基于酶抑制的电化学生物传感器快速检测茶叶中的对氧磷

刘淑娟，钟兴刚，李彦

（1.湖南省农科院茶叶研究所，湖南 长沙 410125；2.湖南省茶叶检测中心，湖南 长沙 410125）

茶是我国传统的经济作物和出口创汇农产品。随着人们生活水平的提高，茶叶的质量卫生状况越来越受到人们的重视。传统的茶叶农药残留检测一般是采用气相色谱仪、质谱仪等仪器对干茶农残进行检测，需要昂贵的仪器设备，并且样品的前处理过程繁琐、检测时间较长。基于对茶叶农药残留监管效率的更高要求，茶叶农残快速检测新技术的开发日益受到重视。

基于酶抑制的电化学传感技术是目前农残快速检测研究最为活跃的领域。胆碱酯酶（ChE）在与有机磷类物质结合后，生物催化活性受到抑制，这一原理可用于有机磷生物传感器的构建。利用此原理构造的有机磷生物传感器具有简单、快速、灵敏、低成本和便于携带等优点[1-3]。国内外关于利用胆碱酯酶和有机磷水解酶检测有机磷的文献已有报道[4-8]，但将这种技术用于茶叶有机磷快速检测的报道极少。

本实验在金电极表面电沉积一层ZrO2纳米粒子以固定乙酰胆碱酯酶，制成胆碱酯酶/ZrO2粒子层/金电极（AChE/ZrO2/Au）电流型生物传感器，用于测定茶叶中的对氧磷。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

金电极和CHI760b电化学工作站购于中国上海辰华仪器厂；电化学反应池为三电极系统，其中胆碱酯酶修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极；乙酰胆碱酯酶（500 U/mg）、氯化乙酰巯基胆碱购于Sigma公司；对氧磷购于国家农药质检中心（沈阳）；电化学测量的支持电解质为0.067 mol/L的磷酸缓冲溶液（PBS），由KH2PO4和Na2HPO4配置而成；其他试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。

1.2 传感器的制备

金电极在使用前分别用0.3 μm和0.05 μm的铝粉抛光至镜面，依次在6 M HNO3、丙酮和二次蒸馏水中各超声清洗2 min，水洗并用氮气吹干。实验开始前，把清洗过的金电极置于0.2 M的硫酸溶液中，在0.5～1.5 V的电位范围内采用循环伏安法扫描至稳定后，用去离子水洗涤并用氮气吹干。将以上处理好的金电极放入5.0 mM 的ZrOCl2·8H2O和0.1 M KCl的混合溶液中，在－1.1～＋0.7 V之间以20 mV/s的速度扫描十个循环，通过电化学扫描实现ZrO2纳米粒子在金电极表面的电沉积，扫描完成后取出电极水洗并氮气吹干。将传感器表面朝上，用微量进样器移取10 μL乙酰胆碱酯酶溶液滴加到二氧化锆电沉积层表面，室温静置2 h，即制得AChE/ZrO2/Au电极有机磷生物传感器。

1.3 检测方法

采用计时电流法检测对氧磷。在含2 mmol/L氯化乙酰巯基胆碱的PBS（pH 7.5）缓冲液中测定传感器的原始响应电流（测定电压为0.45 V）。然后将传感器置于对氧磷溶液中浸泡20 min，在相同条件下检测传感器在底物中的响应电流，根据计时电流的减小程度计算样品溶液中对氧磷的浓度。

1.4 传感器的再生

将传感器放入浓度为5.0 mmol/L的2-PAM 溶液轻度搅拌5 min，即可洗脱有机磷，再生酶的活性。再生后的传感器经清洗后即可用于下一次检测。

2 结果与分析

2.1 传感器工作原理

在金电极表面电沉积二氧化锆纳米粒子以固定乙酰胆碱酯酶，二氧化锆纳米粒子用于有机磷传感器的构造，可使传感器获得较大的比表面积，有利于增加酶的吸附量并保持生物分子（酶）的催化活性，提高传感器的响应性能。

抑制型酶电化学传感器的构建原理是依据乙酰胆碱酯酶催化活性的改变。传感器工作时，底物氯化乙酰巯基胆碱在乙酰胆碱酯酶催化下分解成巯基胆碱和有机酸，而有机磷农药的磷酰基与乙酰胆碱酯酶的活性中心丝氨酸羟基反应，生成共价结合的磷酰化酶，使酶的活性降低，因而底物氯化乙酰巯基胆碱水解反应被抑制，生成的反应产物减少。实验通过电化学方法检测底物氯化硫代乙酰胆碱的水解电流，按下列公式可计算有机磷对乙酰胆碱酯酶的百分抑制率[9]：

式中：A指乙酰胆碱酯酶的百分抑制率，I0指未被有机磷抑制的酶电极的响应电流，I指被有机磷抑制后的酶电极的响应电流。图2显示了电极在吸附有机磷前和被有机磷抑制活性后在底物中的循环伏安图。从图中可看出，被有机磷抑制后传感器的氧化峰和还原峰（c）都明显低于抑制前的氧化峰和还原峰（b）。

2.2 实验条件的优化

实验依据底物氯化乙酰巯基胆碱浓度对缓冲液的pH值进行了选择。结果表明，pH 7.5的PBS磷酸缓冲溶液能较好地保持乙酰胆碱酯酶的活性，且传感器响应电流较大。底物氯化乙酰巯基胆碱浓度为2.0 mmol/L时，传感器的电化学响应最佳。

实验对甲基对硫磷的最佳抑制时间进行了考察。结果表明，乙酰胆碱酯酶的相对活性随着有机磷抑制时间的增加相应降低。当抑制时间小于20 min时，乙酰胆碱酯酶的相对活性随时间增加降低明显；抑制时间大于20 min后，酶的相对活性不再随抑制时间的增加有显著变化。故实验选择有机磷对乙酰胆碱酯酶的抑制时间为20 min。

实验还考察了乙酰胆碱酯酶的浓度对传感器的响应特性的影响。根据在其他条件相同的情况下得到的响应电流可知，酶的活性浓度与传感器的响应灵敏度呈反比；但是，酶浓度过低，传感器响应电流强度减小，传感器的检测线性范围会变窄。实验选择乙酰胆碱酯酶的最佳浓度为50 mU/mL，既能使传感器保持较高的灵敏度，又能获得较宽的检测线性范围。

图2 不同修饰的金电极在PBS在底物巯基胆碱中的循环伏安图

2.3 传感器的电流响应

AChE/ZrO2/Au有机磷传感器被对氧磷抑制后，在底物中的计时电流降低。对氧磷的浓度越大，对电化学信号的抑制作用越明显，传感器在底物氯化乙酰巯基胆碱溶液中的响应电流越小。图3是对氧磷浓度与胆碱酯酶抑制率的负对数曲线图，由图可知，抑制率与甲基对硫磷浓度在5.0×10-7～5.5×10-4g/L范围内成线性关系，最低检出限为1.0×10-7g/L。

2.4 传感器的重现性和稳定性

将制好的对硫磷传感器在相同条件下对对氧磷溶液（浓度为1.0×10-6g/L）重复测定10次，测得乙酰胆碱酯酶抑制率的相对标准偏差为5.26%；将同批次制备的5支对氧磷传感器在相同条件下测定，检测结果的相对标准偏差为4.82%，结果表明，用本方法制作的酶电极，置于pH 7.5的磷酸缓冲液中于4℃冰箱中保存，放置20 d后仍可维持较好的活性。

图3 对氧磷浓度对乙酰胆碱酯酶百分抑制率的校正曲线

2.5 传感器的再生

传感器在完成一次对氧磷检测后，采用1.4所述的方法对传感器进行再生。酶电极连续检测和再生使用6次后活性仍达到最初活性的90%以上（图4）。

图4 传感器再生能力实验

2.6 非特异性试验

实验考察了有机磷传感器在磷酸根离子、硫酸根离子及硝酸根离子等无机离子存在下对响应电流的影响。结果表明，在这类离子存在下，传感器电流响应无明显变化。实验还对传感器在氯氰菊酯、三氯杀螨醇等菊酯类和有机氯类农药存在时的响应电流进行了考察。结果表明，在这类农药残留存在时，传感器的响应电流亦无明显变化。

2.7 回收率实验

实验考察了传感器在6个不同待测茶汤样品添加对氧磷溶液后的回收率。先按照农药的正确使用方法配置一定浓度的对氧磷溶液喷施多个茶叶样品，放置过夜，将茶叶剪碎后浸入丙酮溶液中震荡，过滤后定容至10 mL的容量瓶中。用本文提出的方法检测样品溶液中对氧磷的浓度。然后在各样品中加入已知量的对氧磷溶液，再以同样方法对添加后的样品进行测定，得到的平均回收率在96.05%至105.47%之间，表明试验结果较为准确。

表1 添加回收率试验

2.8 与传统分析方法的比较

为了考察实际应用的可能性，实验用酶传感器检测5个不同对氧浓度的茶叶样品，并将检测结果与气相色谱法得到的结果进行比较，两种方法的测定结果基本相符（表2）。

表2 用传感器法和高效气相色谱法分别测得的茶汤样品中对氧磷的浓度

3 结论

茶叶有机磷农残含量水平直接影响人体健康，也越来越被广大消费者所关注。本文构建的AChE/ZrO2/Au有机磷传感器可直接检测液相中的对氧磷。传感器构造简单，茶叶经简单浸提即可直接用于检测。传感器对目标物对氧磷的检出限低，线性范围宽、灵敏度高、重现性好，而且电极使用寿命较长，操作简便。进一步肯定了该方法在茶叶有机磷检测中的应用效果，可作为茶叶有机磷残留传统检测方法的有力补充。

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