水稻纹枯病菌毒素提取及其对水稻的毒性

李 路，王 玲，刘连盟，侯恩庆，肖丹凤，黄世文

(1.广西大学 农学院，广西南宁 530003;2.中国水稻研究所，浙江杭州 310006)

水稻纹枯病是遍及全球的水稻病害。目前该病已在亚、非、欧、美各洲水稻种植国家普遍发生，一般减产10%～30%，严重时可达50%，对水稻生产威胁很大。随着高产、矮秆、多蘖良种的推广以及种植密度和施氮量的增加，其危害日趋严重，造成很大的损失［1］。该病害由水稻纹枯病菌引起，纹枯病菌在生长代谢过程中会产生毒素。研究表明，水稻纹枯病菌粗毒素对水稻有明显毒害作用，不仅能引起纹枯病的相似病斑，而且抑制胚根生长，致使幼苗萎蔫［2］，这显示毒素在病菌致病过程中起非常重要的作用。长期以来，对水稻纹枯病的防治主要依赖于化学药剂和栽培措施，但防治效果不甚理想［3］。选用抗病品种是防治水稻纹枯病发生为害的有效途径，也是综合防治的关键措施［2］。但之前有关纹枯病抗性鉴定的方法如苗期、成株期鉴定，温室、大田接种等存在费时、费力、费工、出结果慢的缺点，且关于该病抗性品种的快速鉴定方法在国内外鲜见报道［4］。通过探究不同致病力的毒素对不同抗性的水稻种子发芽率、胚根及胚芽生长的影响，旨在探索水稻纹枯病简便、快速、有效的鉴定方法。本试验为水稻抗纹枯病初筛毒素处理进行探索，故利用的材料是已知不同抗性的品种。

现将有关试验结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试水稻品种 (类型):中浙优1号 (杂交稻，较感纹枯病)、秀水09(粳稻，较感纹枯病)、ZH5(籼稻，较抗纹枯病)。

供试菌株:水稻纹枯病菌 GD-118(强致病力)、YN-7(中等致病力)、YN-3(弱致病力)。

以上材料均为本实验室保存。

1.2 粗毒素制备

将3个菌种接种到PDA培养基上，27℃下培养至菌丝长满平板。产毒培养基为改良的Richard培养基:KNO310 g，KH2PO45 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，Fe2(SO4)30.02 g，蔗糖 50 g，蒸馏水1 000 mL，pH值6～7。从平板菌落边缘取直径为5 mm的5块菌丝块至50 mL改良Richard培养基中，27℃下黑暗培养15 d，每天人工振荡2次。

粗毒素提取参照徐敬友等［4］方法:将培养滤液加热，产生白色沉淀后再用滤纸过滤。在滤液中加入30 g活性炭，4℃条件下静置吸附12 h，再以8 500 r·min-1离心15 min。然后，将活性炭沉淀用等体积甲醇洗脱，再将洗脱液于60℃下旋转蒸发浓缩，获得黄色浆状物即为水稻纹枯病菌粗毒素。

1.3 粗毒素生物活性测定

1.3.1 粗毒素对水稻种子发芽的影响

将3个菌种粗毒素分别稀释10，50和100倍。取10 mL毒素稀释液置铺有1层滤纸 (直径10 cm)的培养皿中，重复3次，以蒸馏水为对照。选择健康饱满的上述粳稻、籼稻和杂交稻种子，先将水稻种子用清水预浸2 h，捞起沥干水后，浸入3%H2O2中消毒24 h后捞起，用蒸馏水冲洗干净，然后置于不同毒素稀释液的培养皿内，每皿30粒。在25℃下催芽72 h，记录种子的根长和芽长，计算发芽率。根长和芽长均超过0.50 cm(含0.50 cm)记为发芽。计算公式如下:

发芽抑制率/%=100×(对照种子发芽率 -处理种子发芽率)/对照种子发芽率。

1.3.2 粗毒素对胚根和胚芽生长的影响

用3%H2O2对3种水稻种子消毒24 h，无菌水冲洗，30℃下清水浸种催芽48 h。将种子置于铺有滤纸的含10 mL毒素稀释液的培养皿中，每皿15粒种子，30℃下黑暗培养48 h，重复3次，以蒸馏水为对照，测定胚根和胚芽长度。计算公式如下:

胚根 (芽)伸长抑制率/%=100× (对照胚根或胚芽平均长度-处理胚根或胚芽平均长度)/对照胚根或胚芽平均长度。

2 结果与分析

2.1 粗毒素对水稻种子发芽的影响

3个菌种的毒素粗提物均对水稻种子发芽有不同程度的抑制作用，并且抑制率随着毒素浓度的提高而增大。不同菌株产生的毒素毒性不相同，毒素毒性强弱依次为GD-118＞YN-7＞YN-3。GD-118的毒素稀释10倍后能完全抑制中浙优1号和秀水09的种子发芽。同种毒素相同浓度下，不同类型的水稻种子表现出不同的抗性，抗性从强到弱依次为ZH5＞秀水09＞中浙优1号。YN-3毒素稀释100倍时，ZH5的种子全部能发芽 (表1)。

表1 3种纹枯病菌粗毒素对不同类型水稻种子发芽的影响

2.2 粗毒素对胚根、胚芽生长的影响

催芽后的种子浸入毒素稀释液后，胚芽和胚根的伸长受到了不同程度的抑制。由表2可知，YN-3毒素的毒性相对最弱，毒性最强的GD-118毒素稀释10倍后完全抑制了中浙优1号和秀水09胚根的生长。且毒素对于胚根的抑制程度大于对胚芽的抑制。与发芽率结果相似，ZH5胚根和胚芽的生长对纹枯病菌毒素表现出了较好的耐受性。

表2 3种纹枯病菌粗毒素对不同类型水稻胚根、胚芽生长的影响

3 小结和讨论

试验结果显示，不同抗性类型的水稻品种种子的发芽率、胚根、胚芽生长对相同菌株相同浓度的粗毒素的敏感性反应是不同的。抗性强的品种，对毒素毒性的耐受性就越高，反之亦然。不同致病力的纹枯病菌菌株产生的粗毒素其毒性是不同的，致病力越强，产生的毒素毒性越高。

本实验仅提取了粗毒素用于试验，未对离体叶片的影响进行研究。黄文文等［3］将粗毒素接种在4叶期水稻离体叶片上，3 d后发现叶片上产生病斑，也验证了毒素的致病性。另外，本研究的供试品种较少，今后需进一步研究更多水稻品种对毒素的敏感性和抗感标准，使毒素在纹枯病抗性鉴定中得到更好地应用。对于纹枯病毒素的成分，很多报道的看法不一［3—7］。刘洪涛等［6］认为采用培养产物的毒素混合物比用提纯的单一毒素会更接近病菌在寄主上分泌毒素的组分状态。菌株毒素与品种抗性互作是可以鉴别出水稻品种对纹枯病的抗性的，用纹枯病菌产生的毒素来进行水稻品种或资源的抗纹枯病鉴定是可行的，结果与其他接种鉴定基本一致。

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