荭草的血清药物化学初步研究

王永林，陈慧，郑林，黄勇，何峰，兰燕宇 （贵阳医学院 药学院，贵州 贵阳550004）

荭草为蓼科植物红草Polygonum orientale 的干燥果穗及带叶茎枝，具有清热解毒，祛风除湿，活血消肿功能。常用于风湿性关节炎，冠心病，心胃气痛等疾病［1］，为贵州省少数民族用药。荭草中的主要成分为黄酮及酚酸类化合物，其中原儿茶酸、异荭草素、荭草素等为荭草的特征化学成分，具有抗氧化、抗甲状腺、保护心肌细胞等作用［2］。目前，对于荭草的研究多集中于化学成分的研究，其药效物质基础并不明确。

中药含有复杂的化学成分以及多种药理活性，但只有被吸收的成分才能产生药理作用。传统中药多以口服给药，口服给药后药物成分或经消化道直接吸收入血；或经消化液、消化酶及肠道内细菌的作用分解成次生代谢产物被吸收入血；或经肝药酶（P450）代谢成有活性的代谢产物进入体循环。因此，中药的活性成分及药效物质基础研究应该在给药后的血清中进行［3］。中药血清药物化学是以传统药物化学方法为基础，综合应用多种现代技术，分析鉴定口服中药后血清中代谢成分，研究其药效相关性，确定中药药效物质基础的应用学科［4－5］。应用中药血清药物化学对中药口服后体内药物成分分析从而确定中药药效物质基础的研究已经成功应用于五味子、六味地黄丸、茵陈蒿汤等中药材及复方制剂［6－8］。而对于荭草的血清药物化学、口服荭草的体内过程、药动学研究均未见文献报道。实验中采用中药血清药物化学方法对口服荭草后血清中的成分进行分析，以期找到荭草在体内的有效组分群，为荭草药效物质基础研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Acquity UPLC 系统（沃特世公司，包含二元超高压梯度泵，自动进样器、色谱柱温箱、阵列二级管检测器）；司世EL204万分之一电子天平（梅特勒－托利多仪器上海有限公司）；涡旋混合器ZH－2（天津药典标准仪器厂）；低温冷冻高速离心机Allegra64R（美国Beckman公司）；氮吹浓缩装置MTN－2800D（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂 荭草提取物（贵州省中药民族药研究开发中心制备）；原儿茶酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号809－200102，纯度＞99%）；异荭草素、荭草素、牡荆素、木犀草苷、槲皮素－鼠李糖苷对照品（自制，纯度≥98%，经NMR、MS鉴定，结构正确）；甲醇、乙腈均为色谱纯，甲酸为优级纯，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物 健康成年SD 大鼠，雌雄各半，体质量（220±20）g。均为清洁级动物，检疫合格。购自贵阳医学院实验动物中心。动物许可证号：SCXK（黔）2002－0001。

2 方法

2.1 灌胃药液及供试品溶液的制备 精密称取荭草提取物适量，纯化水溶解，加入少量饱和碳酸氢钠调节pH 至中性，配制成灌胃药液浓度为0.2 g·mL－1。取荭草提取物粉末10 mg，至10 mL 量瓶中，加入甲醇超声溶解，摇匀，20 627×g离心10 min，于－20 ℃保存，备用。

分别精密称取原儿茶酸、异荭草素、荭草素、牡荆素、木犀草苷、槲皮素－鼠李糖苷对照品适量，至10 mL 量瓶中，加甲醇超声溶解，摇匀，配制成质量浓度分别为1.202，0.946，0.844，0.816，0.856，1.200 mg·mL－1的对照品储备液。分别精密移取各对照品溶液50μL 于5 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成混合对照品溶液，于－20 ℃保存，备用。

2.2 空白血清以及给药后含药血清的制备 选取生长状况相似的SD 大鼠12只，雌雄各半，随机分为两组，正常饲养1周，以适应实验室环境。按每次12 mL·kg－1剂量连续灌胃给药3 d，tid，空白组灌胃等体积纯化水。分别于末次给药1 h后股动脉采血，取全血后置于37 ℃水浴至有黄色液体析出，离心取上层血清。将同组血清混合，以消除个体差异。

分别取给药后含药血清、空白血清1 mL，加入0.3 mol·L－1甲酸0.2 mL、甲醇4 mL，涡旋混合，超声后，15 000 r·min－1离心10 min，取上清液于洁净试管中，48 ℃氮气吹干。加入5%乙腈水溶液0.2 mL 溶解残渣，涡旋混合，超声后，15 000 r·min－1离心10 min，取上清液进样分析。

2.3 色谱条件 色谱柱：Waters BET C18（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流动相：乙腈（含0.1% 甲酸）－0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～15 min，A （5%～20%）；15～20 min，A（20%～40%）；20～22 min，A （40%～100%）；22～25 min，A（5%）。检测波长：300 nm；流速：0.3 mL·min－1；柱温：45 ℃；自动进 样室温度：15 ℃。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 精密度试验 取荭草提取物、大鼠灌胃荭草提取物后得到的含药血清样品，按“2.2”项下供试品的制备方法制备样品，分别连续进样6 次，测定峰面积，结果6 次峰面积RSD 在0.4%～2.2%之间，说明仪器的精密度良好。

3.1.2 重复性试验 按供试品溶液制备方法，分别平行制备6份荭草提取物供试品溶液及大鼠含药血清供试品溶液，比较6次进样结果的峰面积进行比较，结果显示6次峰面积RSD 在0.7%～3.7%之间，表明试验方法的重复性良好。

3.1.3 稳定性试验 取含药血清分别于室温放置24 h，4 ℃存储24 h，反复冻融3次后按含药血清供试品制备方法处理样品后，进样分析。结果显示，测得的各共有峰相对峰面积RSD 在1%～4.6%之间，结果表明血清样品在以上条件下的稳定性良好。

取按供试品溶液制备方法制备后的含药血清样品，15 ℃放置48 h，考察含药血清中待测物在样品处理后置于自动进样器中的稳定性，结果显示，各共有峰相对峰面积RSD 在3.7%～6.7%之间，样品在自动进样器中等待自动进样时，48 h内稳定。

3.2 成分分析 分别吸取荭草提取物供试液、对照品溶液1 μL，含药血清、空白血清供试品溶液10μL，于超高效液相色谱仪，进样分析，记录25 min色谱图，并比较分析，确定荭草口服吸收后的入血成分。

3.2.1 荭草提取物化学成分分析 通过对比较荭草提取物及混合标准溶液的UPLC－PDA 指纹图谱，比较保留时间和紫外吸收，对主要色谱峰进行分析归属，见图1、表1。

图1 UPLC指纹图谱A.荭草提取物；B.混合对照品Fig 1 The UPLC fingerprintA.the extracts of P.orientale；B.the mixed standard solutions

表1 荭草提取物UPLC指纹图谱色谱峰归属Tab 1 The UPLC fingerprint of chromatographic peaks for the extracts of P.orientale

3.2.2 荭草提取物口服吸收后的入血成分分析 在相同色谱条件下，大鼠灌胃荭草提取物后含药血清，与空白血清、荭草灌胃药液UPLC 指纹图谱对比，见图2。结果显示：大鼠含药血清中检测到18个代谢产物。其中E1号峰为空白血清中存在的物质，应为大鼠体内内源性物质；1，4，5，6，10号峰等6种成分为荭草原型成分，其中除6号峰外，其余峰与对照品保留时间及紫外吸收对比，分别为原儿茶酸、荭草素、牡荆素、槲皮素－鼠李糖苷。而其余11个成分出峰时间集中于5～20 min之间，可能为大鼠口服吸收荭草后产生的代谢物或机体对药物产生的应激成分。

图2 UPLC指纹图谱A.荭草提取物；B.空白血清；C.末次灌胃荭草提取物1 h后含药血清Fig 2 The UPLC fingerprintA.the extracts of P.orientale；B：blank plasma；C.plasma sample from the rat 1 h after ig the extracts of P.orientale

4 讨论

本文首次应用血清药物化学方法对口服荭草后血清成分进行初步分析，建立了荭草含药血清的超高效液相色谱测定方法，该方法分析时间短，且稳定可靠，重现性好，能够全面反映荭草口服吸收后入血的药物成分，为确定荭草药效物质基础及代谢研究奠定基础，为荭草药材的深度开发提供实验依据。

实验中比较了不同采血时间下大鼠血清指纹图谱，通过比较采血时间为末次给药15，30 min、1，2，3 h的血清指纹图谱，以指纹图谱峰信息丰富程度为前提，确定采血时间为末次给药后1 h。而对于血清供试品制备方法，比较研究了甲醇、乙腈沉淀、醋酸乙酯萃取及HLB固相萃取等方法得到的血清指纹图谱，以甲醇沉淀法最佳，且操作简便，成本低。

实验中通过对比荭草提取物及现有对照品指纹图谱及紫外光谱图，共标定6个已知成分，其中相对含量较大的成分为黄酮类成分。据文献报道，黄酮类化合物口服生物利用度低［8］，所以在实验中我们采取加大给药剂量并多次连续给药的方法，对含药血清进行制备。根据已经标定的荭草提取物中的化学成分，找到5种原型吸收入血的成分。其余2，3，7，8，9号峰等原型成分在体内均未发现原型吸收，可能由于它们所代表的成分在体内不能直接吸收入血，或它们在体内产生药效的形式可能为代谢产物如葡萄糖醛酸化、硫酸酯化等形式。在含药血清中还发现了m1～m12等12 个代谢峰，它们可能是原型成分在体内的代谢转化，或机体吸收荭草后产生的应激性成分。对于在含药血清中找到的大量移行入血的成分，推测它们可能是荭草在体内发挥药效的有效组分群。

［1］ 李勇军，何迅，刘丽娜，等.荭草化学成分研究［J］.中国中药杂志，2005，30（6）：444－446.

［2］ 张颖，高蕊，刘建勋.固相萃取－高效液相色谱法同时检测健康人血浆中的异荭草素、荭草素和灯盏乙素浓度［J］.中国临床药理学杂志，2007，23（4）：299－303.

［3］ 王喜军.中药血清药物化学的研究动态及发展趋势［J］.中国中药杂志，2006，31（10）：759－792.

［4］ 王喜军.中药及中药复方的血清药物化学研究［J］.世界科学技术－中药现代化，2002，4（2）：1－5.

［5］ 段坤峰，孟岩，张兰桐.中药与天然产物中有效成分的体内代谢研究进展［J］.中国医药工业杂志，2009，40（9）：708－713.

［6］ 王喜军，张宁，孙晖，等.六味地黄丸的血清药物化学研究［J］.中国天然药物，2004，2（4）：219－222.

［7］ 王喜军，孙文军，孙晖，等.茵陈蒿汤不同配伍变化对大鼠血中移行成分的影响［J］.中国天然药物，2008，6（1）：43－47.

［8］ 黄莉莉，刘晶，李廷利.五味子水煎物大鼠血清中移行成分分析［J］.中华中医药杂志，2009，24（7）：846－848.