TLR3 基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

喻 钧， 潘铁成， 魏 翔， 刘立刚， 胡 敏

华中科技大学同济医学院附属同济医院心胸外科，武汉 430030

Toll样受体（Toll－like receptor，TLR）是天然免疫中高度保守的病原体相关分子模式（PAMPs）的特异性模式识别受体［1］，是天然免疫识别的关键成分，并参与了致病因子的信号转导过程，在天然免疫中具有重要作用。不少研究发现多种肿瘤细胞表面表达多种TLRs。我们已在前期研究中检测出TLR3在人肺腺癌细胞A549中的表达明显高于正常人支气管上皮细胞HBE。慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞，转移基因片段容量较大，目的基因表达时间较长，不易引发宿主免疫反应等诸多优点。本实验通过构建TLR3RNAi－慢病毒载体，转录至A549 细胞，并通过实时定量PCR、Western blot等方法检测TLR3RNA 干扰的效果，为进一步研究TLR3在肺癌的增殖和免疫逃逸中的作用提供可行的工具。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

实验细胞人肺腺癌细胞株A549和人支气管上皮细胞株HBE 为本实验室所有，均购自ATCC 公司。用含有10%的胎牛血清、100μg／mL 青霉素和100μg／mL链霉素、2 mmol／L 谷氨酰胺的RPMI－1640培养液培养。细胞在37℃和5%CO2实验条件下培养。所有实验均在细胞处于对数生长期时进行。

1.2 实验材料和试剂

胎牛血清、DMEM、Opti－MEM 购自Gibco 公司；双抗为上海新先锋药业有限公司产品；抗体购自Cell Signal公司，PCR 反应试剂、Primer（R＆F）合成、dsDNA oligo、293T 细胞株、大肠埃希菌菌株DH5α、病毒载体均来自上海吉凯基因技术有限公司；Taq 酶、SYBR Master Mixture来自TaKaRa；Age Ⅰ、EcoRⅠ、T4DNA ligase、T4DNA ligase buffer购于NEB；QIAGEN Plasmid大抽Kit购自QIAGEN；Rnase Inhibitor、dNTP、M－MLV 逆转录酶购自Promega；Lipofectamine 2000、Trizol购于Invitrogen；ECL－PLUS／Kit来自Amersham 公司；阳性克隆测序由美季公司完成。总蛋白提取试剂盒购自SBS Genetech公司，鼠抗人TLR3单克隆抗体购自BioLegend公司，二抗试剂盒购于北京中杉试剂公司。

1.3 TLR3基因RNA干扰慢病毒载体制备

针对目的基因靶基因序列，利用公用网站按照RNA 干扰序列设计原则，设计4个RNA 干扰靶点序列，针对靶点合成含干扰序列的DNA oligo（表1）。设计合成的DNA oligo（内含酶切位点）经退火形成双链DNA，与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后的pGCSIL－GFP载体连接。连接反应体系：酶切回收的载体DNA（100ng／μL）1μL，退火的双链DNA（100ng／μL）1μL，10×T4噬菌体DNA 连接酶缓冲液1μL，T4噬菌体DNA 连接酶1μL，加ddH2O至10μL，于4℃连接12h。将连接好的产物转入细菌感受态细胞，用Amp 抗性筛选。挑取重组阳性克隆行PCR 鉴定并行DNA 测序。PCR 鉴定阳性克隆的引物为：上游5′－CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA－3′；下游：5′－GTAATACGGTTATCCACGCG－3′。每个序列阳性克隆各取3个样品菌种进行ABI 3733型测序仪进行测序分析，vshRNA片段测序结果通过Chromas软件进行分析。

表1 TLR3基因短发卡干扰寡核苷酸片段Table 1 shRNA fragments of TLR3

1.4 慢病毒包装阳性克隆及其滴度测定

吉凯基因慢病毒载体系统由pGC－LV 载体、pHelper 1.0 载体和pHelper 2.0 载体3种质粒组成，3 种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提。培养293T 细胞株作为包装细胞。按Invitrogen公司Lipofectamine 2000 使用说明进行共转染293T细胞，转染后8h 更换为完全培养液，培养48h 后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。将收集到的浓缩病毒原液做梯度稀释分组后感染293T 细胞，用荧光镜观察绿色荧光蛋白的表达，测定并标定病毒滴度。

1.5 Real－time PCR内源有效靶点

培养生长状态良好的A549细胞，病毒感染前1 d将细胞分入12孔培养板培养（每孔细胞数约为2×104），感染当天按实验设计的组别分别加入RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验（病毒数与细胞数量的比值MOI＝5）。感染3d后荧光显微镜下观察慢病毒上报告基因GFP表达情况，感染效率大于50%者继续培养，待感染时间达到5d后收集细胞抽提RNA，采用RT－PCR 的方法检测目的基因的mRNA 表达情况。感染效率低于50%的实验组，重新进行感染实验。总RNA 抽提根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行。RNA 逆转录获得cDNA 根据Promega公司的M－MLV 操作说明书进行。Real－time PCR 在Bio－rad 的iQ5上完成。每管反应体系：SYBR premix ex taq 10 μL，上游引物（5 μmol／L）0.5 μL，下游引物（5 μmol／L）0.5μL，cDNA 1.0μL，水8.0μL。设定Real－time PCR 程序：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。制作熔解曲线：PCR 结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA 双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s，同时读取吸光度值。TLR3上游引物：5′－TTACCAGCCGCCAACTTC－3′，下游引物：3′－AGATGACAAGCCATTATGAGAC－5′，扩增长度：288bp。β－actin上游引物：5′－GGCGGCACCACCATGTACCCT－3′；下游引物：3′－AGGGGCCGGACTCGTCATACT－5′；扩增长度：202 bp。

1.6 Western blot验证内源有效靶点

培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前1d将目的细胞分入6孔培养板培养（每孔细胞数约5×104），感染当天按实验设计的组别加入RNAi慢病毒颗粒（TLR3－RNAi－LV 1＃、2＃、3＃、4＃）（MOI＝5），继续培养24h后更换培养液，感染3d后荧光显微镜下观察GFP表达情况，感染效率大于50%者继续培养，感染效率低于50%的实验组，重新进行感染实验。待感染7d后收集细胞蛋白，采用Western blot的方法检测目的基因的表达情况。

1.7 有效靶点慢病毒大量包装

根据实时定量PCR 筛选后的结果，选取最有效的一个RNAi有效靶点，进行病毒的大量包装。实验材料设备，步骤及方法同1.4。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 阳性克隆的PCR 电泳鉴定

采用载体上的引物进行PCR 鉴定阳性克隆。连接入vshRNA 片段的阳性克隆PCR 片段大小为343bp（从载体中切掉24bp）；没有连接入vshRNA 片段的空载体克隆PCR 片段大小为306bp。每个序列阳性克隆各取3个样品菌种送上海美季公司用ABI 3733 型测序仪进行测序分析，vshRNA 片段测序结果通过Chromas软件进行分析。电泳结果显示TLR3vshRNA 片段已经成功插入质粒，且vshRNA 片段大小与我们的预期一致（图1）。挑选的阳性克隆菌液测序结果与实验要求的DNA 序列完全一致，显示序列设计成功，符合我们的预期。

图1 阳性克隆的PCR 鉴定Fig.1 Identification of positive clones by PCR

2.2 慢病毒滴度测定

将浓缩病毒原液梯度稀释后感染293T 细胞，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。图2 为10μL病毒原液1＃、2＃、3＃、4＃（分别稀释10倍至106倍）感染293T 细胞4d后GFP的表达。通过GFP阳性细胞计数法（表达GFP 的细胞数×相应稀释倍数）测定TLR3－RNAi－LV 1＃、2＃、3＃、4＃的滴度分别为2×108、2×108、2×108、1×108TU／mL。

图2 荧光显微镜观察慢病毒感染293T 细胞GFP的表达（×100）Fig.2 GFP expression in 293Tcells after lentivirus transfection by fluorescent microscopy（×100）

2.3 Real－time PCR内源筛靶结果

用针对各靶点的慢病毒（target 1＃，2＃，3＃，4＃）感染A549细胞，3d用荧光显微镜观察GFP的表达，结果显示4 个RNAi病毒的感染效率均＞80%。收集细胞进行Real－time PCR 检测。荧光定量PCR 结果用TaKaRa公司的TP800序列检测系统软件制作扩增曲线（图3a），并输出Ct值，参照2－ΔΔCt数据分析法，进行相对定量计算，比较各样本间TLR3基因mRNA 的表达水平（图3b）。Real－time PCR 检测结果显示：KD4号靶点（target 4＃）是最有效的RNAi有效靶点。相对阴性对照组，该靶点对A549细胞TLR3基因的表达下调约80%。通过绘制熔解曲线对扩增反应进行质控，结果显示该实验得出的熔解曲线峰比较单一，没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，无非特异性信号干扰，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增，说明Real－time PCR 产物纯度较高，具有良好的特异性。

图3 Real－time PCR检测TLR3mRNA 的表达Fig.3 Real－time PCR analysis of TLR3mRNA expression

2.4 Western blot内源筛靶结果

Western blot检测发现构建的4个慢病毒表达载体感染A549细胞后TLR3的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均有下降，差异具有统计学意义（均P＜0.05）；其中KD4 号靶点（target 4＃）的基因沉默效果最明显，蛋白表达量下降了68%（图4）。

2.5 病毒大量包装后的滴度测定

根据实时定量PCR 筛选后的结果，选取最有效的一个RNAi有效靶点即KD4号靶点（target 4＃）进行病毒的大量包装后，测得病毒滴度为1×109TU／mL。

图4 Western blot检测TLR3蛋白的表达Fig.4 Western blot analysis of TLR3protein expression

3 讨论

Toll样受体（TLRs）是果蝇Toll蛋白在哺乳动物中的同源物，属模式识别受体，是非常重要的天然免疫分子，它通过识别微生物的病原相关分子模式（Pathogen－associated molecular pattern，PAMP），引发信号传导，导致炎症介质的释放，在天然免疫防御中起重要作用［1－3］。因此有人认为TLK 控制着由天然免疫向获得性免疫的转变［4］。

现阶段，国内外对于TLR 的研究大多集中于感染、自身免疫性疾病、内源性损伤疾病及器官移植后的排斥反应等免疫学方面的课题［5－6］。随着对TLR 研究的逐步深入，人们逐渐开始关注TLR 和机体肿瘤的关系［7－10］。

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）称为转录后基因沉默，是双链RNA（dsRNA）分子在mRNA水平上封闭相关基因表达过程的技术。人工合成的小分子干扰RNA（siRNA）可以在哺乳动物的细胞中直接触发RNAi而抑制特定基因的表达［11］。

慢病毒载体已成为基因研究中载体使用的热点。慢病毒独特之处还在于它在逆转录酶基因与包膜基因之间以及3′端包膜蛋白基因区含有开放性读码框［12－13］，可能会成为未来RNAi介导肿瘤基因治疗中最常用的载体［14］。利用慢病毒载体结合RNAi技术不仅可以用于基因治疗，而且可以研究细胞中特定基因的功能，这是功能基因组研究的又一突破，并且两种技术的结合还可以克服由dsRNA引起的干扰素效应。

我们已在前期研究中检测出TLR3 在人肺腺癌细胞A549中的表达明显高于正常人支气管上皮细胞HBE。为进一步研究TLR3 在A549 细胞中的作用，本研究构建了4个人TLR3基因RNAi慢病毒表达载体（TLR3－RNAi－LV 1＃，TLR3－RNAi－LV 2＃，TLR3－RNAi－LV 3＃，TLR3－RNAi－LV 4＃），并都经过PCR 检测及测序鉴定，结果证实TLR3基因RNAi慢病毒载体构建成功，经包装产生的慢病毒具有较高滴度。4 种慢病毒载体感染A549细胞后，TLR3基因mRNA 和蛋白表达量均明显下降，其中TLR3－RNAi－LV 4＃抑制作用较明显，使mRNA 表达分别下降80%，蛋白表达分别下降68%（均P＜0.05）。此结果说明本研究构建的慢病毒RNAi表达载体在人肺腺癌细胞内能持续、特异、高效地抑制TLR3 基因表达，为后续研究TLR3在肺癌发生发展中的作用奠定了基础。

［1］ Medzhitov R，Preston－Hurlburt P，Janeway C A Jr.A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity［J］.Nature，1997，388（6640）：394－397.

［2］ Takeda K，Kaisho T，Akira S.Toll－like receptors［J］.Annu Rev Immunol，2003，21：335－376.

［3］ Aderem A，Ulevitch R J.Toll－like receptors in the induction of the innate immune response［J］.Nature，2000，406（6797）：782－787.

［4］ Means T K，Golenbock D T，Fenton M J.The biology of Toll－like receptors［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2000，11（3）：219－232.

［5］ 王家顺，张俊，王建军，等.TOLL 样受体2在大鼠肺移植缺血再灌注损伤期的时序性表达及意义［J］.华中科技大学学报：医学版，2011，40（2）：165－168.

［6］ 刘艳，丰利芳，唐庆，等.孕期补充DHA 对脂多糖所致宫内感染仔鼠脑组织TLR4表达的影响［J］.华中科技大学学报：医学版，2011，40（4）：445－449.

［7］ Luo J L，Maeda S，Hsu L C，et al.Inhibition of NF－kappaB in cancer cells converts inflammation－induced tumor growth mediated by TNFalpha to TRAIL－mediated tumor regression［J］.Cancer Cell，2004，6（3）：297－305.

［8］ Chang Y J，Wu M S，Lin J T，et al.Induction of cyclooxygenase－2overexpression in human gastric epithelial cells by Helicobacter pylori involves TLR2／TLR9 and c－Src－dependent nuclear factor－kappaB activation［J］.Mol Pharmacol，2004，66（6）：1465－1477.

［9］ del Fresno C，Otero K，Gomez－Garcia L，et al.Tumor cells deactivate human monocytes by up－regulating IL－1receptor associated kinase－M expression via CD44and TLR4［J］.J Immunol，2005，174（5）：3032－3040.

［10］ Zheng S L，Augustsson－Balter K，Chang B，et al.Sequence variants of toll－like receptor 4are associated with prostate cancer risk：results from the cancer prostate in sweden study［J］.Cancer Res，2004，64（8）：2918－2922.

［11］ Elbashir S M，Lendeckel W，Tuschl T.RNA interference is mediated by 21－and 22－nucleotide RNAs［J］.Genes Dev，2001，15（2）：188－200.

［12］ Romano G.Current development of lentiviral－mediated gene transfer［J］.Drug News Perspect，2005，18（2）：128－134.

［13］ Dann C T.New technology for an old favorite：lentiviral transgenesis and RNAi in rats［J］.Transgenic Res，2007，16（5）：571－580.

［14］ Wiznerowicz M，Trono D.Conditional suppression of cellular genes：lentivirus vector－mediated drug－inducible RNA interference［J］.J Virol，2003，77（16）：8957－8961.