玉米种子老化过程中抗氧化酶活性的变化

刘建军，马俊华，孟俊文，王自霞，周小梅

（1.山西省农业科学院，山西太原030006；2.山西大学生命科学学院，山西太原030006）

玉米是种植最广泛的谷类作物之一。全世界有100多个国家种植玉米，玉米在世界谷物总产量中仅次于小麦，位居第2。我国玉米常年种植面积近2 400万hm2，总产量约1.28亿t，占粮食总产量的1/4左右。玉米产量的高低，直接影响到我国的粮食生产总量[1]。目前，生产上所用的玉米良种、玉米自交系以及玉米种质资源因保存不妥或存放时间过长引起的种子老化或劣变会造成种子活力丧失及发芽率降低等不可逆转的后果，给农业生产带来严重的经济损失[2]。植物体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸专一性过氧化物酶（APX）等是植物体内活性氧的清除剂，称之为抗氧化酶类，它们共同作用可使细胞内的活性氧维持在正常水平，从而防止活性氧对植物细胞造成的伤害[3-4]。但种子老化会使植物体内活性氧的产生和清除失衡，造成细胞内氧自由基的积累，导致种子失去活力。

本研究选用2个玉米自交系进行玉米种子老化过程中抗氧化酶的变化研究，以探讨种子老化与抗氧化酶活性的相互关系，为种子的安全保存提供一定理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为玉米自交系478和Mo17，由山西丰禾种业2010年在寿阳基地隔离种植收获。其中，478种子水分含量为11.04%，百粒质量为28.7 g；Mo17种子水分含量为10.51%，百粒质量为25.36 g。

1.2 试验方法

1.2.1（58±1）℃热水人工加速老化法（HW） 将种子置于（58±1）℃恒温水浴中处理5～40 min（处理间隔为5 min）（同时以未处理为对照），取出自然晾干，待种子含水量降至初始状态后进行试验。

1.2.2 酶液制备 参照李忠光等[5]的方法，随机选取30粒玉米种子，在温度为26℃的发芽箱中进行萌发，3次重复，取不同萌发时间（0，8，12，16，24，32，36，40，48 h）的种胚，按照种胚的质量∶提取液为1∶5的比例（缓冲液为50 mmol/L，pH值7.0的Tris-HCl）冰浴研磨提取。提取液于2～4℃条件下10 000 r/min离心20 min，取上清液在0～4℃下保存备用。

1.2.3 酶活性的测定 其参照李忠光等[5-6]的方法进行测定。其中，SOD活性采用NBT光还原法测定；POD活性采用愈创木酚显色法测定；CAT活性采用紫外吸收法测定；APX活性采用紫外吸收法测定。

1.3 数据分析

采用SPSS 13.0进行数据统计，采用Student-Newman-Keuls提出的q 测验进行显著性分析（大写英文字母表示1%显著水平），使用Origin 7.5软件作图。数据均用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

对玉米自交系种子478，Mo17进行不同时间的（58±1）℃人工热水老化处理，SOD，POD，CAT和APX活性的变化如表1，2所示。由表1，2可知，老化处理后，SOD活性随老化时间的延长整体上呈递增趋势，POD，CAT和APX活性整体上呈下降趋势，2个玉米种子的变化趋势基本一致，抗氧化酶活性变化均达到显著水平。

表1 （58±1）℃热水老化对玉米478 种子抗氧化酶活性的影响

表2 （58±1）℃热水老化对玉米Mo17 种子抗氧化酶活性的影响

2.1 玉米种子老化过程中SOD 活性的变化

由图1可知，478玉米种子SOD活性随老化时间的延长呈缓慢升高的趋势。在0～25 min的老化时间段，SOD活性保持基本不变，仅老化5～10 min有明显下降，这可能和短时间的热水处理使发芽率提高有一定的关系。萌发初期，种子中SOD活性是随种子萌发代谢的加强而下降，随种子老化活力降低而升高。这可能是由于SOD在干种子内就有储存，所以在种子萌发开始，新的SOD还没有合成，但细胞代谢的加强，消耗了原有的SOD而导致该酶活性的下降。老化25 min后，种子的SOD活性迅速升高，与对照之间存在极显著差异，表明了此时种子的活力迅速下降。有研究也证明，此时老化玉米种子的发芽势和相对活力指数都降到50%以下[7]。说明种子老化到一定程度超出了细胞所能忍受的范围时，其细胞自身的抗性调节能力开始下降。

由图2可知，老化玉米Mo17种子SOD活性的变化趋势与478相似，活性变化曲线缓慢升高。从老化5 min开始，SOD活性一直平稳升高，至20 min以后活性变化不大，并处于一个较高的水平。

从2种玉米种子老化过程中SOD的升降变化幅度可以看出，478种子比Mo17种子耐老化性强，而且种子活力较高，说明不同品种自身的抗氧化调节能力不同，种子活力不同。

2.2 玉米种子老化过程中POD 活性的变化

由图3可知，玉米478种子POD活性随老化处理时间的延长而下降，在老化处理20 min内，POD活性变化不大，只在5 min时，比对照有所升高，这是由于短时的热水处理刺激种子本身所做出的应急反应；在20～30 min期间，POD活性迅速下降；30 min之后，POD活性降到一个较低的水平，基本保持不变。老化20 min的478玉米种子发芽率仍在80%左右[7]，此时的POD活性还较高，随后POD活性急剧下降，到30 min后发芽率降至50%左右[7]，种子活力与POD活性的密切相关，表明了POD活性可作为一个检测指标显示种子活力的高低及丧失的特性。

由图4可知，老化的玉米Mo17种子POD活性的变化趋势类似于478，不同的是Mo17种子POD活性从老化的开始就一直平稳下降，而478种子的POD活性变化则是慢—快—慢。说明随着老化加剧，细胞中POD活性清除过氧化物的能力降低，进一步对细胞造成严重损伤，导致种子活力发生不可逆转的下降，直到死亡。

2.3 玉米种子老化过程中CAT 活性的变化

由图5，6可知，老化处理后的玉米478和Mo17种子，CAT活性都随老化时间的延长而缓慢下降，但2个玉米种子对照的CAT活性差别较大，Mo17对照的CAT活性只有478对照的1/3。478种子老化5～40 min，CAT酶活性下降了54%，而Mo17只下降了27%。说明老化可使种子中CAT活性降低，清除过氧化氢的能力减弱，种子活力下降，不同品种耐老化能力不同。

2.4 玉米种子老化过程中APX 活性的变化

由图7，8可知，老化处理后，478和Mo17种子的APX活性随老化时间的延长呈下降的趋势，2个玉米种子的APX活性差别较大。Mo17种子的APX活性是478种子的4倍，在老化20 min之前，Mo17的APX活性下降幅度远远大于478，25 min后二者的APX活性表现相差不大，都降到了较低的水平。

3 讨论

植物在正常的生理代谢过程中，O2·-不断产生同时又在不断被清除，维持了一个生理性低水平和相对恒定的浓度[8]，由此保证了植物的正常生长和发育。种子萌发过程中，O2·-产生速率上升的同时，SOD活性也逐渐增加。SOD活性受到O2·-产生速率的诱导，这种内源SOD活性的上升反映了植物自身的一种保护机制，而这种SOD活性的增加使O2·-限制在一定水平内，使O2·-不会对植物本身造成伤害[8-9]。种子在老化过程中细胞内会产生大量的O2·-，SOD的表达合成升高。过多的活性氧可以与生物大分子如蛋白质、核酸等发生反应，改变其原来的生理功能，引起植物体伤害甚至死亡。因此，在植物细胞中保持正常的生理代谢，抗氧化酶类SOD，POD，CAT和APX的作用十分明显[10-12]。

通过对玉米自交系Mo17，478种子人工老化过程中SOD，POD，CAT，APX活性变化规律进行研究，揭示了不同品种的活力不同，不同品种自身的抗氧化调节能力不同。老化使玉米种子细胞内POD，CAT和APX的活性降低，清除过氧化物的能力下降，造成H2O2等活性氧在种子内积累，导致细胞膜的膜脂质过氧化，进而对细胞造成严重损伤，导致种子活力发生不可逆转的下降，直到死亡[13-15]。

本试验结果表明，除SOD活性随老化时间的延长不断升高外，POD，CAT和APX的活性均随老化时间的延长整体呈下降趋势。因此，在玉米种质资源保存和商品玉米种子贮藏中，POD，CAT和APX的活性可作为检测玉米种子活力高低的一个重要指标。

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