Zn2+对富锌酵母生物量与细胞形态的影响

王 娟，高国赋，王 智 ，魏宝阳

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省农业信息与工程研究所，湖南 长沙 410125）

众所周知，锌是动物生长必需的微量元素，它参与动物机体组成，以酶的活化因子参与体内物质代谢，维持机体正常的生理功能并作为调节因子影响细胞复制和分化。目前，国内在饲料中使用的铁、锌等微量元素主要以硫酸亚铁、硫酸锌等无机形态添加，这种形态在应用中出现了很多弊病，如动物吸收率低，与饲料中其他营养成分协同配伍性差，影响了铁、锌的吸收利用[1]。大量试验表明，有机态微量元素有容易被动物吸收、利用性高等特点[2]。由于酵母菌安全且营养丰富，因此成为人们用来研究微生物富集微量元素的主要载体之一。酵母菌虽然有一定的富锌能力，但如果培养基中锌的浓度过高则会对酵母菌产生毒性，抑制酵母菌的生长[3-5]，因此研究不同浓度Zn2+对酵母细胞生长的影响十分必要。试验研究了不同Zn2+浓度下酵母菌生物量与细胞形态的变化，旨在为酵母锌的研究和开发应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由湖南省植物保护研究所陈玉荣老师提供。

1.2 培养基

3%麸皮固体培养基：30 g麸皮加200 mL水，煮25min后，用4层纱布过滤，添加2%琼脂，再加水配成1 000 mL溶液，用三角瓶分装，每瓶100 mL，121℃灭菌20min，制备平板培养基和斜面培养基。

富锌液体培养基：30 g麸皮加200 mL水，煮25min后，用4层纱布过滤，再加水配成1 000 mL溶液，三角瓶分装（每瓶100 mL）灭菌后添加灭菌的 ZnSO4·7H2O，使 Zn2+浓度分别为 0.01、0.05、0.08、.01、0.40、0.80 mol/L。

1.3 酵母菌对Zn2+耐受力的测定

将没有富锌的啤酒酵母作为出发菌种，先接种1×104cfu的啤酒酵母于Zn2+浓度为0.01 mol/L的麸皮培养液中，28℃、150 r/min摇瓶培养2 d；再取菌液在不含锌的麸皮固体培养基上划线分离培养单菌落，28℃倒置培养，2 d后挑取长势较好的酵母菌落转接于斜面培养基保存，将保存的斜面菌种转接于更高的含Zn2+培养液中同条件下摇瓶培养。循环上述过程，对菌种进行富锌能力的测定。

1.4 Zn2+对酵母生长的影响

根据酵母菌对Zn2+耐受力的测定结果，以不同Zn2+浓度的富锌培养基接种酵母菌，28℃、150 r/min摇瓶培养2 d。分别取不同Zn2+浓度的富锌培养基摇瓶培养后的酵母菌悬液制作临时装片，在显微镜100倍和400倍的条件下观察酵母细胞形态并拍照。采用光密度法测量酵母菌的生物量，取菌液1 mL稀释10倍后在590 nm处测吸光值。

2 结果与分析

2.1 酵母菌对Zn2+耐受力的测定

在不同Zn2+浓度下,酵母菌在麸皮培养基上的生长速度和菌落形态差异比较明显。在没有加Zn2+时，酵母菌生长迅速，酵母菌落呈乳白色，湿润，边缘整齐；在Zn2+浓度为0.01 mol/L时，酵母菌生长迅速，菌落形态没有明显变化，仍呈乳白色，湿润，边缘整齐；Zn2+浓度为0.08 mol/L时，酵母菌生长较为缓慢，菌落体积略有减小，菌落乳白色，边缘整齐，易挑取；Zn2+浓度为0.40 mol/L时，酵母菌生长缓慢，菌落数目少，部分菌落边缘不整齐，颜色呈半透明，难以挑取；Zn2+浓度为0.80 mol/L时，酵母菌不生长。通过酵母菌对锌的耐受力的测定发现，酵母菌对锌的耐受力较强，在对菌种进行富锌能力驯化过程中，培养液中Zn2+浓度提高到0.40 mol/L时，该酵母菌菌株仍然可以生长，并能富集一定量的锌，但当Zn2+超过一定的浓度后，会对酵母的形态和生长产生影响。因此，试验以0.01、0.05、0.08、0.10 mol/L的富锌液体培养基培养，观察Zn2+对酵母菌生长的影响。

图1 不同Zn2+浓度对酵母菌生物量的影响

2.2 Zn2+对酵母生物量的影响

从图1中可以看出，Zn2+对酵母的生物量有明显的影响，低浓度（0～0.010 mol/L）Zn2+能促进酵母的生长，随着 Zn2+的浓度（0.05～0.10 mol/L）的增加，对酵母的生长有抑制作用。出现该现象的原因可能是Zn2+在酵母的生命活动中影响了相关酶的活性，Zn2+作为一些酶的激活剂，在适当的条件下可以促进相关酶的活性，当Zn2+的浓度增加到一定的程度时，影响了培养液的渗透压，同时也对部分酶有抑制作用，从而影响了酵母的生物量。

从上述结果可以看出，用酵母来富集Zn2+生产酵母锌的产品时，Zn2+的富集是有一定的上限的，应控制培养基中Zn2+的浓度，让酵母在不严重影响产量的条件下富集Zn2+，这对富锌酵母的育种和生产有一定的指导意义。

2.3 Zn2+对酵母细胞形态的影响

图2 不同Zn2+浓度对酵母细胞形态的影响

从图2中可以看出，对照组中酵母细胞形态体积较大且形态多样，多为出芽状、链状或椭圆形，此外还有少量细胞呈圆形；当Zn2+浓度为0.01 mol/L时，细胞体积略有减小，细胞形态主要是圆形或是出芽状，且圆形的细胞明显增多；当Zn2+浓度提高至0.08 mol/L时，细胞主要呈圆形；当Zn2+浓度为0.1 mol/L时，极少数细胞形态正常，绝大部分酵母细胞形态不规则，部分细胞呈圆形且聚集成片，形成大块的细胞碎片。Zn2+对酵母细胞形态的影响，主要体现在以下几个方面：（1）随着培养液中Zn2+浓度的升高，酵母细胞的体积逐渐变小，只能偶尔观察到体积较大的细胞（图2-1～图2-4）。（2）随着Zn2+浓度的升高，出芽状的细胞逐渐减少，细胞多数呈圆形，当Zn2+浓度达到某一值时开始出现形态不规则的细胞（图2-1、图2-5）。（3）随着培养液中Zn2+浓度的升高，菌液中的细胞碎片增多，许多圆形的细胞聚集破碎形成细胞碎片（图2-6）。

Zn2+对细胞形态影响产生的可能原因是，高浓度的Zn2+影响了酵母细胞细胞壁合成有关酶的活性，使酵母细胞细胞壁的合成受到抑制，从而导致酵母细胞形态的改变，即由椭球形变成圆球形，甚至有的细胞不完整，出现不规则的形态。

3 讨论

锌是与动物体新陈代谢关系密切的重要微量金属元素之一[6]，酵母菌具有良好的富锌能力，因而有关酵母锌的研究一直受到广泛的关注。试验初步研究了Zn2+对酵母菌生物量以及细胞形态的影响，结果表明，低浓度的Zn2+能够提高酵母菌的生物量，高浓度的Zn2+会降低酵母菌的生物量；随着Zn2+浓度的升高，酵母细胞的体积会逐渐变小，出芽状的细胞越来越少，圆球形的细胞增多，有的甚至是不规则的；此外，高浓度的Zn2+会使酵母细胞聚集破裂形成大块的细胞碎片。

有关Zn2+对酵母菌生物量及细胞形态影响的机理未见文献报道。推测Zn2+可能影响了酵母菌细胞壁的合成和透性。前人研究表明，Zn2+在酵母细胞中富集的主要部位是细胞壁，Bray等[7]认为，酵母细胞在富集金属离子的过程中，细胞壁是吸收积累金属离子的主要场所，细胞壁中蛋白质-甘露聚糖组成的外层比几丁质-葡聚糖组成的内层更重要，并发现与金属离子结合是细胞壁主要成分的一个功能；张之申等[8]研究认为，锌是在少量蛋白质参与下与酵母细胞壁多糖强烈络合而形成的多糖-锌-蛋白络合物，这种观点与镉、铜等能大量络合在细胞壁上一致；此外，薛冬桦等[9]报道药用锌酵母种的锌大部分为有机锌，51%的锌结合在酵母的细胞壁上，45%的锌在短肽、氨基酸和无机盐中，其余分布在线粒体和微粒体上。Zn2+是酵母细胞细胞壁合成有关酶的激活剂和抑制剂，加入低浓度的Zn2+，能激活相关的酶，从而提高生物量；而高浓度的Zn2+影响了培养液的渗透压，同时也对部分酶的活性有抑制作用，影响酵母细胞壁的合成，从而影响酵母的形态和生物量。细胞壁能够稳定细胞的形态，控制物质运输，细胞壁骨架的改变会引起细胞形态发生变化，细胞壁透性的严重改变可能会导致细胞破碎，但Zn2+改变酵母细胞壁的结构和透性的机制还需进一步研究。

[1]李淑敏，史秀云，丁宏标，等.富铁锌真菌作为饲料添加剂的研究[J].中国畜牧杂志，1997，33（3）：9-11.

[2]李淑敏.酵母作为微量元素载体的研究及应用前景[J].饲料工业.1998，19（2）：29-310.

[3]Incharitable A，Kitjaharn P.Zinc biosorption from aqueous solution bya halotolerant cyanobacterium Aphanothece halophytica[J].Curr Mcrobiol，2002，45：261-264.

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[5]Guerinot M，Eide D.Zeroing in on zinc uptake in yeast and plants[J].Curr Opin Plant Biol，1999，2（3）：244-249.

[6]Gaither L，Eide D.Eukaryotic zinc transporters and their regulation[J].Bio Metals，2001，14：251-270.

[7]Bray D，Stoll A D，Starke L，et al.Chemical and enzymatic extraction of heavy metal binding ploymers from isolated cell walls of Saccharomyces cerevisivae[J].Biothehnol.Bioeng.1994，44：297-302.

[8]张之申，郭锡勇，李向东，等.锌酵母中酵母多糖组分的分离纯化和分析[J].微量元素与健康研究，1995，12（1）：48-49.

[9]薛冬桦，金 花，肖 毅.药用锌酵母培养吸收应用研究[J].中国生物工程杂志，2003，23（6）：72-75.