Taq DNA聚合酶的制备和纯化

詹庆才，詹祎捷，刘之熙，朱克永

（1.湖南省水稻研究所，湖南 长沙 410125；2.北京联合大学应用文理学院，北京 100083）

PCR技术被广泛应用于分子生物学、食品科学、医学等相关研究领域。作为PCR技术的主要试剂的Taq DNA聚合酶用量日益增多。而目前大多数实验室主要依赖公司商品化的Taq DNA聚合酶。为了降低研究和开发成本，一些实验室利用不同的分离纯化方法生产Taq DNA聚合酶[1-4]。湖南省水稻研究所生物技术室利用含Taq DNA聚合酶基因的p Taq表达质粒转化大肠杆菌E.coli菌株，诱导表达耐热Taq DNA聚合酶，然后提取纯Taq DNA聚合酶，并用考马斯亮蓝法和PCR分析其纯度、浓度和活性。该技术旨在制备Taq DNA聚合酶，降低分子生物学实验成本。

1 材料与方法

1.1 材 料

含Taq酶基因的载体p Taq由中国科学院遗传与发育研究所提供，氨苄青霉素（Amp）、溶菌酶、苯甲基磺酰氟（PMSF）、异丙基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG）、Taq DNA 聚合酶、DNA Marker等生物化学试剂购自鼎国生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外源基因在大肠杆菌中的表达 取出菌种，将少许的冰冻菌种培养物在LB平板（含Amp100 mg/mL）上划线，37℃培养 16～20 h。挑取单菌落接种到6 mL含100 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；用1.25 mL过夜培养的菌种接种到250 mL的LB液体摇瓶中（Amp终浓度为100 mg/mL），37℃培养4.5 h；在总量1 000 mL的培养液中加入120 mg的IPTG诱导（终浓度为0.5 mmol/L）。培养液在37℃，继续培养16～20 h。

1.2.2 重组Taq DNA聚合酶的提取 3 000 g离心20 min收集菌体，每1 000 mL菌液离心后加入60 mL（30 mL×2）溶液 A（50 mmol/L Tris-HCl pH值 8.0；50 mmol/L Dextrose （glucose）；1 mmol/L EDTA）中重悬；将收集菌体洗，7 000 g离心10 min重新收集菌体。菌体再悬在40 mL（20 mL×2）溶液A中，混匀。加入终浓度为4 mg/mL的lysozyme（Sigma），室温（25℃）放置 15 min。加入 40 mL的溶液B（10 mmol/L Tris-HCl pH值 8.0；50 mmol/L KCl；1 mmol/L EDTA （pH 值 8.0）；1 mmol/L PMSF；0.5%Tween 20；0.5%NP-40），75℃水浴保温1 h，期间要晃动几次。4℃，10 000 g离心20 min重新收集上清液。上清液中加入5%PE（I聚乙烯亚胺），使终浓度为0.15%（体积比），加入时用磁力搅拌器搅拌，慢慢地逐滴加入。室温下继续搅拌10 min。4℃，10 000 g离心15 min重新收集沉淀。用24 mL的含25 mmol/L KCl的溶液C（20 mmol/L Hepes pH 值 7.9；1 mmol/L EDTA（pH 值 8.0）；0.5 mmol/L PMSF；0.5%Tween 20；0.5%NP-40）再悬，并洗涤沉淀。4℃，7 000 g离心15 min，收集沉淀。用24 mL含150 mmol/L KCl的溶液C再悬沉淀。4℃，2 500 g离心10 min，收集上清液。测量收集上清液的体积，使收集的上清液最终KCl的浓度为50 mmol/L（通过加入2倍体积的不含KCl的溶液C）。此时即完成了上柱前样品的准备。

1.2.3 重组Taq DNA聚合酶的纯化 称取7 g Bio-Rex 70的干树脂，放在小烧杯中，用双蒸H2O洗，去掉漂浮的小颗粒，室温溶胀2 h，期间换几次双蒸H2O。用含50 mmol/L KCl的溶液C预平衡，装层析柱。装好树脂后再用6～10倍柱床体积的含50 mmol/L KCl的溶液C平衡柱子。检查进入柱子和流出柱子的溶液C的pH值不变，将样品装在平衡好的层析柱上。

层析柱用6倍体积（约60 mL）以上的含50 mmol/L KCl的溶液C再次平衡。样品用含200 mmol/L KCl的溶液C洗脱。一般准备50 mL洗脱液，以3 mL体积在试管中分部收集。将含Taq酶较集中的分部收集在一起，放在透析袋中。用500 mL溶液 D（20 mmol/L Hepes pH 值 7.9；100 mmol/L KCl；0.1 mmol/L EDTA；0.5 mmol/L PMSF；1 mmol/L DTT；50%glycerol），4℃透析 20 h 左右，期间换一次透析液。透析后得到约2～3 mL的酶液。从透析袋中取出酶液，立即与20 mL溶液D混合，储存在－20℃以下，以保持酶的长期稳定性。

1.2.4 重组Taq DNA聚合酶的活性测定 PCR扩增反应检查所纯化的Taq DNA聚合酶的活力，以目前实验室所用的Taq DNA聚合酶商品酶为对照。PCR反应在10μL的反应体积中进行，包含1 μmol引物，1 μL DNA 样品（10 ng），0.5单位市售Taq DNA聚合酶或0.1μL自制的Taq DNA聚合酶，1μLlO倍PCR反应液（100 mmol/L Tris-HC1，pH 值 8.3；15 mmol/L MgCl2，500 mmol/L KC1，质量分数为0.01%的明胶）。所用引物为：正向序列5’-TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC-3’；反向序列：5’-GGTGATCCTTTCCCATTTCA-3’。

扩增反应条件为：94℃变性4 min，然后是94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，进行 35 个循环，最后72℃延伸7 min。反应采用96孔PCR盘在PE公司9700型基因扩增仪上进行。扩增产物在质量浓度为4%的Nusieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭染色，紫外光下观察拍照。

2 结果与分析

2.1 重组Taq DNA聚合酶分离纯化的结果

用3 mL的离心管分部收集层析分离的Taq DNA聚合酶，在SDS-PAGE上电泳，以购买的Taq DNA聚合酶做对照。确定哪个部分含Taq DNA聚合酶和含量的多少，根据电泳结果判断酶的制备是否成功。一般Taq DNA聚合酶在第3、4、5个分部中被洗脱下来。

2.2 重组Taq DNA聚合酶的活性

利用等量的分离纯化的重组Taq DNA聚合酶与市售的Taq DNA聚合酶同时进行PCR扩增。结果表明，自制重组Taq DNA聚合酶与市售重组DNA聚合酶有相似的活性，都可扩增出目的DNA片段，等量自制重组Taq DNA聚合酶和市售产品扩增出的DNA量相同（图1），说明自制产品与市售产品有相似的比活性。

3 讨论

重组DNA Taq DNA聚合酶的分离纯化有硫酸铵沉淀法[1，5-6]、利用 Ni柱亲和色谱法[2]、AKTA 蛋白纯化系统[3]及冻溶法[4]等方法。研究利用Taq DNA聚合酶耐热性强的特点，采用溶菌酶、NP40裂解细菌热变性沉淀杂蛋白，Bio-Rex 70柱层析透析，克服了溶冻法、硫酸铵沉淀法不能充分除去杂蛋白，AKTA蛋白纯化系统虽然能得到高质量的产品，但成本较高。通过优化分离纯化条件，得到了高纯度的重组Taq DNA聚合酶，且保持了很高的活性，制备的Taq DNA聚合酶完全能满足分子生物学实验的要求。

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[2]丁燕华，刘树涛，齐庆远，等.Taq DNA聚合酶热纯化制备[J].安徽农业科学，2011，（39）：10153-10155.

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[5]王云天，秦 川，杨 瑞，等.基因重组Taq DNA聚合酶的制备[J].新乡医学院学报，2007，（24）：551-553.

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