薇甘菊萎蔫病毒感染对薇甘菊光合特性和4种酶活性的影响

2013-12-16王瑞龙潘婉文杨娇瑜张晖夏晴晴苏贻娟曾任森

生态学报 2013年5期

王瑞龙，潘婉文，杨娇瑜，张晖，夏晴晴，苏贻娟，曾任森，*

(1.华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广州 510642;2.农业部华南热带农业环境重点实验室，广州 510642;3广东省普通高等学校农业生态与农村环境重点实验室，广州 510642)

研究表明，植物体感染病毒后常出现花叶、矮化、叶片皱缩、顶枯等症状，从而使植物的营养生长受到抑制，严重时可引起植物局部或系统坏死［1-4］。寄主植物感染病毒后体内会发生复杂的生理生化变化，如光合速率下降，叶绿素降解，叶绿体受到破坏，光化学活性下降等［3-6］。病毒侵染可引起与植物抗病反应有关的一些酶类如超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)和多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)等活性的变化［7-10］。

薇甘菊(Mikania micrantha H.B.K.)是菊科(Compositae)假泽兰属(Mikania)多年生草质藤本，属世界性杂草，原产地为中南美洲［11］，是我国危害性极强的外来入侵植物，目前已经入侵到广东、广西、海南、云南、香港、台湾、澳门等地［11-13］。因其生长速度快，种子量巨大且极易扩散，可以覆盖其他植物引起森林生态系统退化，对当地的生态环境造成巨大的破坏［12-14］，控制薇甘菊在我国的蔓延已经刻不容缓。

作者发现一种可致使薇甘菊叶片出现萎蔫、叶畸形、皱缩等症状的新病毒，将其命名为薇甘菊萎蔫病毒(Mikania micrantha wilt virus，MMWV)，该病毒属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)蚕豆病毒属(Fabavirus)龙胆花叶病毒(Gentian mosaic virus，GeMV)的一种新的分离株［15-16］。实验室内和野外试验表明，MMWV虽不能使薇甘菊致死，但可有效地抑制薇甘菊的生长，MMWV有可能成为生物防治薇甘菊入侵的方法之一［15-16］。

本文从生理生化角度研究了MMWV侵染对薇甘菊光合特性及与植物抗病反应相关的4种主要酶活性的影响，旨在探明MMWV侵染对薇甘菊生理生化指标的影响，为利用MMWV生物防治薇甘菊提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

MMWV分离自田间发病的薇甘菊，利用分子生物学方法鉴定属于MMWV［15-16］。

薇甘菊茎段采自华南农业大学试验农场，剪成长度约9 cm的茎段，扦插在直径为16 cm的花盆中，每盆1株。待成活后选长势良好、大小一致的薇甘菊40株。

1.2 试验方法

1.2.1 接种处理

在薇甘菊幼苗长到有5—6片叶时，采用常规汁液摩擦方法接种MMWV，以接种磷酸缓冲液为对照，分别在接种处理后第8、16、24、32天采集接种叶片并测定各项指标。

1.2.2 SOD 活性的测定

SOD的测定参照王爱国［17］的方法。称取薇甘菊叶片0.25 g，液氮研磨后加入2.5 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液，涡旋10 s，12000 r/min离心15 min，取上清液为酶液，4℃保存备用。将0.05 mol/L磷酸缓冲液1.5 mL，130 mmol/L 甲硫氨酸溶液 0.3 mL，750 μmol/L 氮蓝四唑 0.3 mL，100 μmol/L EDTA-Na20.3 mL，20 μmol/L核黄素0.3 mL，酶液50 μL，蒸馏水0.25 mL加入到比色杯中。混匀后将一管置于黑暗处，其余各管置于4000 lx日光灯下反应20 min。反应结束后，以黑暗处的为空白对照，分别测定吸光度值，重复4次。

1.2.3 PAL 活性的测定

PAL的测定用分光光度法［18］。称取薇甘菊叶片0.1 g，液氮研磨后转移至2 mL的离心管中，加入1 mL PAL酶提取液，振荡1 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清液为酶源，4℃保存备用。在试管中各加入0.02 mol/L L-苯丙氨酸1 mL，0.05 mol/L Tris-H2SO4缓冲液 2 mL，0.5 mL 酶液，对照只加入0.5 mL PAL 酶提取液。40℃水浴30 min，在290 nm处测吸光度值，以OD290 nm值变化0.01为一酶活力单位，重复4次。

1.2.4 POD 活性的测定

POD采用愈创木酚法测定，参照袁庆华等［10］的方法。称薇甘菊叶片0.25 g，液氮研磨后转入离心管，加2.5 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2，内含5% 聚乙烯基吡咯烷酮)，振荡10 s，12 000 r/min离心15 min，取上清液，4℃保存备用。在比色杯中依次加入1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)，1 mL 0.1 mol/L愈创木酚，1 mL 0.8%H2O2，50 μL酶液后迅速用封口膜封口摇匀，在470 nm处测吸光度值，记录0—120 s的OD470值，每10 s记录1次，重复4次。

1.2.5 PPO 活性的测定

PPO测定参照朱广廉［19］的方法，略有改进。称取薇甘菊叶片0.25 g，液氮研磨后转入离心管，加入少量预冷的0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8，内含5% 聚乙烯基吡咯烷酮)，振荡10 s，12 000 r/min离心15 min，取上清液，4℃保存备用。在试管中加入3.9 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8);1 mL 0.05 mol/L儿茶酚溶液;0.1 mL酶液。37℃ 15 min，迅速转入冰浴并加入2 mL 20%三氯乙酸溶液终止反应，在525 nm处测吸光度值，重复4次。

1.2.6 叶绿素含量的测定

参照舒展等［20］的方法，称0.1 g薇甘菊叶片放入研钵中，加少量石英砂研磨成糊状，用80%的丙酮水溶液分批提取叶绿素，直至残渣无色为止。将丙酮提取液过滤后定容，分别在663、645和440 nm处测吸光度值。根据下列各式计算出叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量，叶绿素a/b的比值［21］，重复4次。

1.2.7 光合作用参数测定

用LI-6400便携式光合仪(LI-COR，Nebraska，USA)测定MMWV侵染32d后及健康对照薇甘菊叶片在8:00—11:30的光响应曲线，测定时光强梯度由强到弱，依次设定光量子通量密度(photon flux density，PFD)为1500、1000、800、600、400、200、100、80、40、20和0 mmol·m－2·s－1，叶室温度设置为25℃，测定时将参比室的CO2浓度稳定在 380 μmol·mol－1，在每个光梯度下平衡 180 s后测定净光合速率(net photosynthetic rate，Pn)［22］。每株测定顶端第5片叶子，重复5次。依据Bassman和Zwier［23］的方法拟合Pn-PFD曲线，计算最大净光合速率(Maximal net photosynthetic rate，Pmax)、表观量子效率(Apparent quantum yield，AQY)、暗呼吸速率(Dark respiration rate，Rd)、光饱和点(Light saturation point，LSP)和光补偿点(Light compensation point，LCP)。模型的参数通过SPSS 16.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)的非线性评价模型进行计算。

1.3 数据处理

运用SPSS 16.0对实验数据进行分析，用独立样本t检验分析MMWV侵染对薇甘菊叶片光合特性的影响，所有数据均为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 MMWV侵染对SOD、POD、PPO和PAL活性的影响

从图1可以看出，健康对照薇甘菊叶片内SOD活性保持相对稳定，接种MMWV后，薇甘菊叶片中SOD活性在接种后8—16d分别比对照提高了19.20%和14.19%。而接种MMWV 24—32d后，薇甘菊叶片内SOD活性逐渐减低，其中第32天达到最低值，比对照减低了25.37%。接种MMWV后引起薇甘菊叶片内POD活性发生明显变化。接种8d后，POD活性比对照逐渐升高，第24天达到最大值，比对照增加了41.12%，24d后POD活性有下降的趋势，但仍显著高于对照组。薇甘菊接种MMWV 8d后，叶片内PPO活性达到最大值，比对照显著增加了77.75%。接种后16—32d PPO活性总的变化趋势与健康对照组基本一致。接种MMWV 8d后，薇甘菊叶片中PAL活性比对照显著增加了23.58%。随后接种薇甘菊叶片内PAL活性开始降低，之后PAL活性又升高，第24天再达峰值，即PAL活性曲线有2个酶峰。第32天感病叶片内PAL活性比对照显著减低了20.53%。

2.2 MMWV侵染对薇甘菊叶片叶绿素含量的影响

健康对照薇甘菊叶片中的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量、叶绿素a/b保持相对稳定。受MMWV侵染的薇甘菊叶片中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量自接种后第8天开始缓慢下降，至32d后下降幅度最大。MMWV侵染薇甘菊32d后，薇甘菊叶片中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量、叶绿素a/b分别比对照组减少了 30.76%，18.76%，26.41%和 17.84%(图 2)。

2.3 MMWV侵染对薇甘菊叶片光合特性的影响

MMWV侵染对薇甘菊叶片的Rd，LCP和AQY无显著影响，其中MMWV侵染使叶片的LCP比对照增加17.53%。MMWV侵染薇甘菊使其叶片的Pmax和LSP分别比对照显著减少32.34%和12.52%，表明MMWV侵染可影响薇甘菊叶片的光合效率(表1)。

表1 MMWV侵染对薇甘菊叶片光合参数的影响Table 1 Photosynthetic parameters in the leaves of Mikania micrantha after infection by MMWV

图1 MMWV侵染对薇甘菊叶片中SOD、POD、PPO、PAL活性的影响Fig.1 Changes of SOD，POD，PPO and PAL activities in the leaves of M.micrantha after infection by MMWV

3 讨论

研究表明病毒侵染可引起寄主植物体内SOD，POD，PPO等与植物抗病性相关的酶活性变化［7-8，10，24-26］。野生大豆(Glycine max)的PPO和PAL活性与对大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus，SMV)的抗性呈显著正相关，可利用叶片中PPO和PAL活性水平作为野生大豆病毒病抗性鉴定的参考指标［8］。研究发现烟草接种黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)的PE、M和Xb等3种毒株后，Xb和M毒株可引起SOD活性前期升高、后期活性下降;M毒株导致PAL活性一直保持在较高水平，而PE毒株则导致PAL活性下降。PE和M毒株均导致POD酶活性升高［7］。本实验结果显示MMWV侵染薇甘菊前期可诱导SOD、POD、PPO和PAL活性提高，尤其是PPO活性比健康对照增加了77.75%。随着侵染时间的增加，感病薇甘菊叶片中SOD、PPO和PAL的活性逐渐降低，而POD的活性则保持相对较高的水平(图1)。同理黄瓜(Cucumis sativus)苗期感染黄瓜枯萎病(Fusarium axysporum f.sp.cucumerinum Owen)后，叶片组织中POD，SOD，PPO活性变化曲线存在2个酶峰，PAL活性变化曲线存在1个单峰;其中抗病品系的POD和PAL活性的提高与抗性呈显著正相关，而SOD和PPO活性的提高与抗性呈极显著正相关［9］。

病毒侵染寄主植物后，在细胞内大量地复制、增殖可破坏寄主细胞叶绿体结构和功能使叶绿素含量下降［23，27］，导致寄主植物的光合作用效率降低甚至死亡［1，5-16，28］。番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)侵染可导致番茄(Lycopersicon esculentum)叶片中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量、净光合速率和气孔导度分别比健康植株下降50.2%、24.19%、43.84%、43.28%和27.07%［2］。马铃薯 Y 病毒(Potato virus Y，PVY)侵染马铃薯(Solanum tuberosum)60d后，侵染叶片中的净光合速率、叶绿素含量和电子传递速率分别减少了49.4%、40.2%和 72.9%［4］。芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)侵染青菜(Brassica chinensis)和芥菜(Brassica juncea)后导致寄主叶片的叶绿素含量、光合速率、蒸腾速率明显降低［3］。蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2，BBWV 2)B935和PV131侵染蚕豆(Vicica faba)使感病蚕豆叶片中叶绿素含量减少，叶绿素a/b值逐渐降低［29］。本研究结果显示MMWV侵染薇甘菊32d后使叶片中叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量显著减低(图2)，同时叶片中Pmax和AQY分别比对照显著降低了32.34%和12.52%(表1)。表明MMWV侵染可影响薇甘菊叶片中叶绿体的结构和功能，从而导致叶片光合效率降低。病毒侵染导致寄主的叶绿素含量降低是由于叶绿体结构发生破坏所致［27］，碳同化酶活性下降，可能是造成光合作用速率降低的主要原因［4，30-31］。

图2 MMWV侵染薇甘菊后不同时间阶段叶片中叶绿素含量Fig.2 Chlorophyll contents in the leaves of Mikania micrantha at different stages after infection by MMWV

目前防治薇甘菊的措施主要有4种即人工清除、化学防除、生物防治和生态控制［11］。人工清除适用于薇甘菊危害面积较小的区域，大面积人工清除费时费力且易复发。化学防除易造成环境污染，薇甘菊可能在数年后再次为害。生物防治是利用薇甘菊的病原微生物和天敌昆虫(真菌、细菌、病毒、螨类等)进行控制。Ellison等［32］发现薇甘菊柄锈菌Puccinia spegazzinii仅侵染薇甘菊属植物。安婀珍蝶(Actinote anteas)［33］、紫红短须螨(Brevipalpus phoenicis)［34］和小蓑蛾(Acanthophyche sp)［35］等可取食薇甘菊的茎叶。田野菟丝子(Cuscuta campestris)可控制薇甘菊生长，但不能根除薇甘菊［11］。生态控制目前主要是利用幌伞枫(Heteropanax fragrans)［11］和芒萁(Dicranopteris pedata)［36］等本地物种控制薇甘菊的生长。发现和利用天敌控制外来入侵生物作为新兴的方法值得做深入的研究［15-16］。研究发现MMWV侵染薇甘菊30d后，其茎的长度、根、茎和叶的鲜重分别比健康对照植株减少了75.3%、75.6%、79.5% 和91.6%，MMWV可抑制薇甘菊的生长［16］。当前，薇甘菊的防治仍是世界性难题，研究所发现的天敌虽可使薇甘菊致病甚至死亡，但在实际应用中控制薇甘菊的扩散尚未见报道［11，15，37］。

本研究表明MMWV通过降低薇甘菊叶片的光合特性和与抗病性相关的酶活性，从而抑制薇甘菊的生长。虽然该病毒有望被用来进行薇甘菊的生物控制，有关生态风险评价尚需深入研究。

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