黄瓜籽乙酸乙酯提取物对人成骨肉瘤细胞骨形态发生蛋白-2的影响

李 娜，潘 志，唐 燕，陈 新，宋 宁，张洪长*

(1.长春中医药大学研发中心,长春 130117；2.长春中医药大学药学院，长春 130117)

·实验研究·

黄瓜籽乙酸乙酯提取物对人成骨肉瘤细胞骨形态发生蛋白-2的影响

李 娜1，潘 志1，唐 燕1，陈 新2，宋 宁2，张洪长1*

(1.长春中医药大学研发中心,长春 130117；2.长春中医药大学药学院，长春 130117)

目的 通过测定骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的表达,探讨黄瓜籽乙酸乙酯提取物(CSA)对人成骨肉瘤(MG63)细胞的活性的影响。方法 采用体外培养MG63细胞,给予CSA与MG6置于37 ℃，5%CO2饱和湿度培养箱中共同孵育48 h,MTT比色法检测黄瓜籽提取物对细胞活性的影响；生化法检测ALP含量，ELISA法定量检测BMP-2的含量；免疫组化法测定BMP-2表达。结果 MTT法，CSA具有明显促进MG63细胞活力(Plt;0.01);免疫组织化学染色法，CSA细胞中的BMP-2的表达量明显高于空白组;CSA组ALP和BMP-2含量高于空白组(Plt;0.01)。结论 CSA对MG63具有保护作用，能够有效的提高MG63细胞的生存率，其机制可能与促进BMP-2表达、升高ALP和BMP-2的含量有关。

黄瓜籽；ALP；BMP-2

黄瓜籽，异名哈利苏，为葫芦科黄瓜属黄瓜CucumissativusL.的干燥成熟种籽。黄瓜籽具有续筋接骨、祛风的功效，主治骨折筋伤，风湿痹病[1]。现代研究证实，黄瓜籽具有促进人体骨骼再生的功效[2]，黄瓜籽多肽具有促进成骨细胞增殖、分化及抗骨质疏松作用[3]；在民间治疗骨科疾病已有悠久的历史，广泛用于接骨壮骨及补钙。本实验利用ELISA法(HE染色及免疫组织化学方法测定)检测碱性磷酸酶(ALP)和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的含量,免疫组化测定BMP-2的表达变化，探讨黄瓜籽提取物促进骨折愈合在分子水平的作用机制，为黄瓜籽治疗骨折的研究及开发治疗骨折的新药奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 药品制备 黄瓜籽提取物由长春中医药大学药学院配制，将黄瓜籽粉碎成粗粉，采用仿生化提取法[4]，乙酸乙酯系统分离，得到有效部位(CSA)，配成浓度为1 mg/mL的检测样品溶液，置2 ℃冰箱备用。

1.2 细胞株、主要试剂及仪器 MG63细胞(购于吉林省肿瘤医院)，胎牛血清、1640培养基和胰蛋白酶均购自于GibcoBRL公司。兔抗人BMP-2抗体、羊抗兔二抗购自于Pe-protech公司，DAB KIT显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。碱性磷酸酶(ALP)生化检测试剂盒购于南京建成，BMP-2ELISA试剂盒购自美国Ramp;D公司。CO2培养箱购自Thermo公司，550型酶标仪购自美国BIO-RAD公司，Leica石蜡切片机，Leica摊片机，Leica包埋机均为德国Leica公司产品。

1.3 细胞培养 将MG63细胞置于含有10%胎牛血清和青链霉素各100 U/mL的1640培养基,在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱内常规培养，待细胞长至80%融合时进行实验，常规换液以维持细胞处于对数生长期状态。

1.4 MTT法测定细胞活力 将MG63细胞接种于96孔板，每孔5×104/mL的细胞悬浮液200 μL、37 ℃、5%CO2培养24 h。当细胞完全贴壁生长后，吸弃培养液，分别加入不同质量浓度(10、100、500 μg/mL)的含药培养基，以10%FCS-DMEM培养基为对照，继续培养48 h。加入MTT(质量浓度为5 g·L)，每孔20 μL，置于培养箱孵育4 h后甩板，每孔加入150 μL DMSO使其显色，37 ℃振动孵育10 min，使结晶溶解完全，置于酶标仪490 nm处检测吸光度(OD值)。

1.5 生化指标检测 调整细胞体积浓度约1×105/mL，接种于6孔板内。待细胞融合达到70%时，取MTT法筛选最佳给药剂量进行给药(100 μg/mL)，用PBS冲洗3次，加入0.2 mL裂解液，用刮刀将细胞刮下，移至EP管中，13 000 r/min离心30 min，收集上清按试剂盒说明要求，检测细胞上清液中ALP和BMP-2的含量。

1.6 免疫组织化学法 调整细胞体积浓度1×105/mL，接种于6孔板(内置无菌盖玻片)内。待细胞融合达到70%时，按照MTT法筛选最佳给药剂量100 μg/mL给药，用PBS反复洗涤3次，甲醇固定30 min,去除固定液，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX100作用20 min，加入BMP-2抗体(1∶50稀释)，室温作用1 h，二抗用PBS稀释200倍，辣根酶标记。DAB显色，苏木素复染。于荧光倒置显微镜观察。

2 结果

2.1 CSA对MG63细胞增殖作用(OD值)影响 CSA促成骨细胞增殖作用明显，且当给药质量浓度为100 μg/mL时，促增殖作用最为明显；当给药浓度为500 μg/mL时，对细胞增殖有抑制作用，说明浓度过大时有细胞毒性。提示黄瓜子微波制品的仿生化乙酸乙酯提取部位促骨细胞增殖效果最明显。见表1。

2.2 CSA对ALP、BMP-2含量的影响 与对照组比较，给药组的ALP含量均有升高(Plt;0.01)。由此可知，CSA均能够有效的促进成骨细胞MG63对ALP、BMP-2的分泌，从而促进骨形成，起到防治骨质疏松的作用。见表2。

表1 CSA对MG63细胞增殖作用(OD值)影响

注：与对照组比较，#Plt;0.05。

表2 CSA对ALP，BMP-2含量的影响

注：与对照组比较，##Plt;0.01。

2.3 BMP-2免疫组织化学染色 BMP-2免疫组织化学染色显示，CSA处置细胞后,给药组细胞BMP-2呈明显阳性,胞浆内分布着棕黄色颗粒表达增强。说明CSA具有保护MG63细胞的作用。见图1。

A:对照组；B:CSA图1 各组MG63中BMP-2的表达(免疫组织化学，×200)

3 讨论

近年来，由于基因技术的发展应用，人们对骨折愈合的认识已从细胞生物学向分子生物学水平深化，并随着分子生物学的不断发展，已经认识到骨折愈合与多种生物因子有关[5-7]。随着骨诱导理论的提出,人们发现BMP对未分化间充质细胞具有独特的诱导其向成骨细胞方向转化并进而形成新骨的作用[8-9]。骨折愈合主要受局部骨生长因子的调控[10-11]，中药能有效地促进骨折愈合过程中BMPS的表达[12-13]，影响骨折愈合过程中BMP-2的合成，缩短骨折愈合的进程[14-16]，研究证明中药能诱导生物体内BMP的合成。本实验围绕黄瓜籽有效成分的发现及其可能的对促进成骨细胞内BMP-2合成及其表达影响,进行了研究。MTT结果显示，黄瓜子微波制品的仿生化乙酸乙酯提取部位对MG63细胞具有保护作用，能够有效的提高MG63细胞的生存率；黄瓜籽乙酸乙酯提取部位具有增加成骨细胞内BMP-2表达的作用,促进ALP的合成，提示黄瓜籽促进骨折愈合的机制可能与促进BMP-2表达、升高ALP的含量有关，同时为黄瓜籽可促进成骨细胞内BMP-2的表达提供了佐证，也为中药治疗骨折的研究及开发治疗骨折的新药提供了理论基础，值得进一步的研究。

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EffectofEthylAcetateExtractofCucumisSativusSeedonBMP-2ofMG63

LI Na1,PAN Zhi1,TANG Yan1,CHEN Xin2,SONG Ning2,ZHANG Hongchang1*

(1.Center of Research and Development,Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

ObjectiveTo evaluate the expression of bone morphogenetic protein (BMP-2) of ethyl acetate extract of cucumis sativus seed on the Human Osteosarcoma MG63 cells.MethodMG63 cells with CSA were in vitro at 37 ℃ and 5% CO2saturated humidity incubator in common incubation 48 h.Cell viability was measured by MTT assay,and expression of BMP-2 was performed by the method of immunohistochemistry and ELISA.ALP was detected by Biochemical method.ResultCSA can obviously promote MG63 cells vitality(Plt;0.01) by MTT.The amount of the expression of BMP-2 in the CSA group wasobviously higher than that of blank group by Immunohistochemical staining.ALP and BMP-2 level of CSA group were higher than that of blank group (Plt;0.01).ConclusionCSA has a protective effect and can effectively improve the cell survival.Its mechanism may be related to promotion of the expression of BMP-2 and increase of the content of ALP and BMP-2.

cucumis sativus seed;ALP;BMP-2

R285.5

B

1003-5699(2013)12-1255-03

吉林省卫生厅科研课题(2009S012)；吉林省中医药管理局课题(2010-071)。

李 娜(1978-),女，药学博士。研究方向：分子药理学研究。

*

张洪长，电话：0431-86172082，电子信箱：zhc1961@hotmail.com。

2013-11-04)