交沙霉素产生菌JM8 和R18 的发酵代谢研究

胡 平，林开春

(1．恩施职业技术学院 生物工程系，湖北 恩施445000;2．华中农业大学 植物科学与技术学院，湖北 武汉430070)

交沙霉素(Josamycin)是一种大环内酯类抗生素，由那波链霉菌交沙霉素变种(Streptomyces narbonensisvar．Josamyceticus)产生，其结构与柱晶白霉素的A3 组分相同［1－2］，结构式见图1．交沙霉素最早由日本山之内制药株式会社于1964 年研制而成［3－4］，而后研究人员于1980 年完成了交沙霉素的全合成［5］．交沙霉素自诞生就在世界范围内广泛应用于临床，常用于副鼻窦炎、支气管炎、肺炎、呼吸道感染、中外耳炎、术后感染、皮肤感染和口腔科、五官科、泌尿科感染等，效果显著．但在我国交沙霉素的工业发酵水平很低，生产成本高，使得国内尚无厂家生产原药．交沙霉素的生产主要靠进口原料药，严重阻碍了国内交沙霉素药物的发展，必须提高交沙霉素的发酵生产能力，一方面提高提高生产菌种的产素能力，另一方面重视发酵工艺的选择［5－6］．本研究通过对诱变前后的两个菌株发酵曲线的比较，探讨了诱变前后菌株发酵过程中的代谢变化，为选择交沙霉素的发酵工艺提供参考．

图1 交沙霉素分子结构式Fig．1 Molecular structure of Josamycin

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．1．1 仪器与试剂 ①仪器:双人单面垂直洁净工作台(上海苏净)，H－2050R 高速冰冻离心机(长沙湘仪)，高效液相色谱仪(BECKMAN GOLDEN50)，16L 机械搅拌不锈钢发酵罐(江苏科海)，TKY－I 回转式恒温调速摇瓶柜(上海杜科)，BT224S 电子天平(赛多利斯)，UV2600紫外可见分光光度计(上海天美)．②试剂:苯酚溶液:称取10 g 苯酚，用95%的乙醇定容至100 mL;磷酸缓冲液:0．02 mol/L KH2PO4溶液，用1 mol/L 的H3PO4调节pH 值为3，备用．

1．1．2 试验菌株 交沙霉素生产菌株由武汉天惠生物工程有限公司研究所提供．试验菌株JM8 是出发菌株，菌株R18 是JM8 诱变的高产菌株．

1．1．3 培养基 ①孢子斜面培养基:土豆泥10%，麦片2．5%，精氨酸0．02%，琼脂2%，消前pH7．2～7．4;②种子培养基:黄豆饼粉1．5%，淀粉1．0%，葡萄糖1．0%，酵母粉0．5%，MgSO40.05%，CaCO30．3%，K2HPO40.5%，消前pH8．0;③发酵培养基:玉米淀粉4．0%，棉籽饼粉2．0%，面筋粉2．0%，葡萄糖2．0%，豆油1．0%，CaCO30．3%，KH2PO40.03%，MgSO40.05%，消前pH8．0．

1．1．4 参考品 交沙霉素标准品为杭州民生药业生产的交沙霉素糖衣片，用甲醇溶解配制成1 000 μg/mL的母液标样，用0．25 μm 滤膜过滤除菌除杂质，4℃保存备用．

1．1．5 DNS 溶液(Ghose 法) 称取6．9 g 结晶酚溶解于15．2 mL 10%的氢氧化钠溶液中，用水稀释至69 mL，并加入6．9 g 亚硫酸钠配制成甲液;将255 g 酒石酸甲钠溶解于300 mL 10%的氢氧化钠溶液中，再加入1%的3，5－二硝基水杨酸溶液880 mL 配制成乙液;将甲、乙溶液混合储存于棕色瓶中，室温下放置7～10 d后使用，1 年内有效．

1．2 试验方法

1．2．1 发酵工艺流程 将JM8 菌株和R18 菌株分别接种于茄瓶斜面孢子培养基，28℃培养7～10 d，洗下孢子接入种子培养基，于28℃摇床(180 r/min)，培养时间30h，按10%的接种量接入16 L 发酵罐，装料量为10 L，通气量5 L/min，转速210 r/min，罐压0．02 MPa，28℃发酵10 d，分别在发酵3．0、4．0、5．0、6．0、6．5、7.0、7.5、8．0、8．5、9．0 d 时取发酵样液备用．

1．2．2 高效液相色谱法测定发酵效价 将待测溶液用0．25 μm 滤膜过滤，取上清液上C18 反向色谱柱(填料Hypersil ODS 25 μm，4．6 mm×250 mm)，以磷酸缓冲液－甲醇(体积比为20 ∶80，pH 3)为流动相，进样10 μL;控制流速为1．0 mL/min，232 nm 检测;参考品的配制同1．1．4．

1．2．3 菌丝湿重的测定 取不同发酵时间的发酵样液10 mL 于4 000 r/min 转速下离心10 min，除去上清液备用，称取湿菌丝重量．

1．2．4 发酵液中总糖和还原糖浓度的测定(DNS 分光光度法)［7］吸取发酵上清液1 mL，加入1 mL 6 mol/L的盐酸，沸水浴30 min，用去离子水适当稀释，即为总糖测定稀释液;吸取发酵上清液1 mL，用去离子水适当稀释，即为还原糖测定稀释液．分别取稀释液1 mL 于比色管中，加入1 mL DNS 溶液，沸水浴10 min，取出冷却至室温，加入4 mL 去离子水混匀，以空白的发酵液为对照，测定540 nm 处吸光值，根据标准曲线求得原发酵液总糖和还原糖浓度．

1．2．6 发酵液滤速的测定 用移液管吸取不同发酵时间的样液30 mL，用滤纸过滤，测量2 min 的滤液体积．

2 结果与分析

2．1 碳源浓度测定标准曲线的制定

取少量葡萄糖于105℃烘干至恒重，称取烘干的葡萄糖0．1 g，加去离子水配制成1 mg/mL 的葡萄糖标准母液．将母液依次稀释，配制成100、150、200、250、300、350、400 μg/mL 等7 个不同浓度的标样，取各种浓度标样1 mL，加入1 mL 的DNS，沸水浴10 min，冷却至室温，再加入4 mL 的去离子水稀释混匀，测定540 nm 下吸光值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线见图2，曲线方程为:y=0．003 3x－0．149 2，R2=0．999 3，可以看出，DNS法能准确地标定溶液中葡萄糖的浓度．

称取干燥的氯化铵0．382 g，用去离子水定容至100 mL，即为铵氮浓度为0．1%的标准溶液，将母液稀释1 000 倍即铵氮浓度为1 mg/L，作为溶液A．分别取A 液0、20、40、50、60、80 mL，再加入去离子水定容至100 mL，作为标样;取以上不同浓度的标样各10 mL，加入0．4 mL 的苯酚溶液，摇匀，再向其中加入0．4 mL 0．5%的亚硝基铁氰化钠溶液，再次摇匀，并分别向其中加入1 mL 的C 液，摇匀，静置1 h，在640 nm 波长下，以浓度为横坐标，吸光值值为纵坐标，绘制标准曲线见图3，求出曲线方程为y=1．2532x+0．0203，R2=0．9998，表明该方法能准确地标定溶液中的浓度．

图2 葡萄糖标准溶液的吸光曲线Fig．2 Extinction curve of glucose standard solution

图3 标准溶液的吸光曲线Fig．3 Extinction curve of standard solution

2．3 菌株JM8 和R18 发酵过程中代谢曲线测定结果

按照方法1．2．1 对菌株JM8 和R18 分别上罐发酵，用酸度计测定发酵样液的pH 值，并按方法1．2．2、1．2．3、1．2．4、1．2．5 和1．2．6 测定发酵效价、菌丝湿重、糖浓度、浓度和滤速，具体结果见表1～2，绘制代谢曲线见图4～5．

表1 菌株JM8 的代谢参数与培养时间的关系Tab．1 The relationship of some metabolic parameters and cultivation time of JM8

从图4 和图5 可以看出，菌株R28 在发酵液中比菌株JM8 生长更快，延迟期也更短，在对数生长期，菌体能迅速利用营养物质，生长迅速，进入产物合成期后，菌体浓度变化不大，发酵液的pH 值缓慢升高，碳源和氮源物质的消耗变慢，交沙霉素逐渐积累．发酵液的滤速先升后降，主要是因为培养基中玉米淀粉因逐渐消耗而使发酵液慢慢变稀，随后又因发酵代谢物的增加又开始变稠;随着发酵时间的增加，菌丝湿重和发酵效价逐渐增加，在发酵5d效价大幅度提高，且发酵液中总糖和还原糖的浓度迅速下降，的浓度也缓慢下降，表明交沙霉素的积累与发酵液中碳源的利用具有较强的相关性，发酵8 d 效价达到最高点，但是浓度几乎不变，而在8～9 d，浓度陡然升高，可能是菌丝体老化自溶，释放氮源物质的缘故，此时发酵效价甚至表现出下降的趋势，所以应把握好发酵时间，以发酵8 d 放罐为宜．

图4 菌株JM8 发酵液中各代谢参数曲线Fig．4 Metabolic parameters of JM8 fermentation fluid

图5 菌株R18 发酵液中各代谢参数曲线Fig．5 Metabolic parameters of R18 fermentation fluid

3 讨论

交沙霉素是那波链霉菌交沙霉素变种的一级代谢产物［9］，其生物合成的内脂环是由5 个乙酸单位、1 个羟基乙酸单位、1 个丁酸单位、1 个丙酸单位通过聚酮体途径缩合而成．比较2 个菌株发酵的代谢曲线，发现在发酵前期两个菌株的发酵液pH 的变化不大，到了中后期发酵液的pH 值逐渐升高，但的浓度与pH没有表现出相关性．因此在发酵中期应注意对pH 值的调控，使pH 适宜降低，且控制在5．7 以上．诱变菌株R18 比出发菌株JM8 能更好的利用能源物质，且菌体生长快，表明交沙霉素的发酵工艺条件选择，发酵培养基的配方更重要，能被菌株很好利用的能源物质配比才能有效发挥菌株的产素能力，碳源曲线变化最快时，效价曲线变化也最快．所以在生产中，当发现碳源代谢加快时，应适当补入一些碳源，使菌种在一个较为稳定的环境中生长和产素，这与交沙霉素的生物合成原理相符．氮源曲线的变化则表明，生产过程中浓度应保持在300～400 g/L，如果浓度陡然上升，则发酵异常对产素不利，发酵8 d 效价最高，因而在生产中要把握好发酵周期，不宜过长．否则，会导致交沙霉素的提炼困难，费时费料．

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