响应曲面法优化欧李种壳碱性多糖的提取

邬晓勇，刘云山，顾若璇，刘晨玲，苟小军

(成都大学 药食同源植物资源开发重点实验室，成都 四川610106)

欧李(Prunus humilisBunge．)为蔷薇科樱桃属多年生落叶矮生灌木，是我国特有的古老野生树种，株高0.5～1．5 m，是目前世界上最矮小的木本果树．主要分布于黑龙江、辽宁、内蒙古、河北、山东和山西等省区，在向阳山坡或沙丘边缘生长较多，资源相当丰富［1］． 欧李无刺、果大、有柄、高产，而且保鲜期长，可以鲜食，可用于加工果汁［2］、酿酒［3］．欧李果实营养价值高，尤其是钙和铁的含量比一般水果都高，且欧李所含的钙为天然活性钙，易被吸收，适宜老人和儿童补钙［4］，便诞生了其商品名“钙果”．

碱性多糖具有增强免疫力，防衰老等药理作用［5］．碱溶性多糖类抗肿瘤作用的一大优点就是毒副作用小，且与化疗药物有协同效应并能抵抗化疗药物对骨髓的抑制等毒副作用［6］． 但目前仍未有对欧李多糖研究的相关文献，本实验以欧李种壳为材料，对于其中的碱溶性多糖进行提取，利用响应曲面法对其提取条件进行优化，旨在为欧李资源利用提供依据．

1 材料与方法

1．1 试验材料

从成熟的欧李果实中取种壳，干燥、粉碎制得粉末．

1．2 试验方法

浓硫酸、浓盐酸、葡萄糖、苯酚、NaOH(均为分析纯)．

分光光度计、精密天平、托盘天平、恒温水浴锅、pH 计、离心机、抽滤机．

1．3 方实验法

1．3．1 葡萄糖标准曲线制作 硫酸苯酚法［7］测定葡萄糖糖含量:准确称取1．00 g 葡萄糖加蒸馏水溶解，于250 mL 容量瓶定容，制得0．4 mg/mL 的葡萄糖溶液．将制备好的0．4 mg/mL 的葡萄糖溶液用蒸馏水稀释成0.2、0．1、0．05、0．025、0．012 5、0．006 25 mg/mL 浓度的溶液．将制备好的各种浓度的葡萄糖溶液用硫酸苯酚溶液于沸水浴显色30 min，用分光光度计490 nm 比色［8］．以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，并建立标准曲线方程．

1．3．2 欧李种壳碱溶性多糖提取的单因素实验 多糖提取单因素实验操作流程:准确称取欧李种壳粉末1.00 g，选定加热时间、加热温度、液料比、NaOH 浓度进行提取，抽滤;用浓盐酸中和到pH7．00 左右，定容为100 mL，然后稀释50 倍后硫酸苯酚法显色，在490 nm 分光光度计下比色，选定最佳单因素．

1．3．3 响应曲面法设计 每次试验取欧李种壳粉末1．00 g，选定加热温度(A)、加热时间(B)、NaOH 浓度(C)、液料比(D)作为考察的4 个因素，各设3 个水平(见表1)，以多糖的含量为考察指标，选用响应曲面法进行试验．

表1 欧李种壳碱溶性提取多糖的因素水平Tab．1 Factor levels of alkali－soluble polysaccharide extraction from nuclear shell of Cerasus humilis．

利用Design Expert 软件对四个因素进行响应曲面设计(见表2)．按照表2 进行实验，确定最佳的碱性多糖提取条件．

表2 欧李种壳碱性多糖提取的响应曲面设计表Tab．2 Response surface design table of alkali－soluble polysaccharide extraction

2 结果与分析

2．1 葡萄糖标准曲线

由1．3．1 试验方法，以吸光度和葡萄糖浓度建立标准曲线，如图1 所示，并建立标准曲线方程:y=4．055 9x+0．022 2，线性相关系:R2=0．995 1．

2．2 单因素实验

2．2．1 NaOH 浓度对碱溶性多糖提取的影响 在实验条件为80℃、液料比(mL/g)20 ∶1、加热时间4 h 的条件下，NaOH 浓度分别为0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3.5、4．0 mol/mL 进行实验，考察NaOH 浓度对碱溶性多糖提取的影响，试验结果见图2．

图1 葡萄糖标准曲线图Fig．1 Standard curve ofglucose

图2 NaOH 浓度对多糖提取的影响Fig．2 The influence of NaOH concentration on polysaccharide extraction

由图2 可知，NaOH 浓度在3．5 mol/L 之前，欧李种壳碱溶性多糖的提取百分含量随着NaOH 浓度的增加而增加，大于3．5 mol/L 之后，多糖的百分含量反而随着浓度的增大而减小．这是由于溶液的碱性有助于解除细胞壁聚合物分子间的物理和化学作用，从而提高多糖产率，但过高的碱浓度会由于发生脱酯和消去反应而引起多糖结构的破坏［9］．选取NaOH 浓度为3．5 mol/mL 比较合适．

2．2．2 液料比对碱溶性多糖提取的影响 在其他条件同2．2．1 项一样的情况下，分别取浓度3．5 mol/mL NaOH 溶液，液料比10、15、20、25、30、35 mL/g 条件进行实验．考察液料比对碱溶性多糖提取的影响，结果见图3．

由图3 可知，多糖百分含量随着液料比的增加而增大，当液料比超过25 mL/g 时，多糖的得率呈下降趋势．这是由于增大液料比可以使物料与溶剂接触面积增大，使多糖被充分的提取出来，但液料比过大，也使其它成分被过多溶出［10］，这些成分可能会与多糖发生反应，从而导致多糖的提取降低． 因此最适液料比为25 mL/g．

2．2．3 加热时间对碱溶性多糖提取的影响 在其他条件同2．2．2 项一样的情况下，取浓度3．5 mol/mL NaOH 溶液，液料比25 mL/g 分别加热0．5、1、2、3、4、5 h 条件进行实验．考察加热时间对碱溶性多糖提取的影响，试验结果见图4．

图3 液料比对多糖提取的影响Fig．3 Theinfluence of solvent－material ratio on polysaccharide extraction

图4 加热时间对多糖提取的影响Fig．4 The influence of heating time on polysaccharide extraction

由图4 可知，多糖百分含量在随着加热时间的延长而增加．一直到5 h 处多糖百分含量随着加热时间的延长还有所增加．所以，为了节约时间和成本，确定多糖提取的加热时间为5 h．

2．2．4 加热温度对碱溶性多糖提取的影响 在其他条件同2．2．3 项一样的情况下，取浓度3．5 mol/mL NaOH 溶液，液料比25 mL/g 加热时间5 h，加热温度为60、70、80、90、100℃条件进行实验．考察加热温度对碱溶性多糖提取的影响，结果见图5．

由图5 可知，随着温度的升高，多糖的提取得率逐渐升高，这说明温度越高对欧李细胞的破坏作用越大，有利于多糖的浸出．但是，温度太高，特别是在100℃左右时，欧李种壳提取液的多糖含量提取变得很少，这可能有两种原因:一是由于在高温下欧李细胞开始处于“崩溃”、溶解的状态;另外的可能是欧李中含有的多糖在100℃左右糊化，因此欧李提取液变成粘稠度很浓的状态．这种高粘的液体对于固液分离是不利的，完全影响到欧李种壳碱溶性多糖的提取．因此加热温度在80℃时提取出来的多糖百分含量相对最多．则最佳的加热温度应选取80℃．

图5 加热温度对多糖提取的影响Fig．5 The influence of heating temperature on polysaccharide extraction

2．3 响应曲面法试验结果

响应曲面法试验后，各组的试验结果见表3．

表3 响应曲面法试验结果表Tab．3 The test results of response surface method

根据表3 的数据，用Design Expert 工具对数据进行了分析，得到了响应曲面的方差分析表(见表4)．

表4 响应面二次模型方差分析表Tab．4 The anova table of response surface quadratic model

利用Design Expert 软件对表4 中响应值进行二元回归拟合，获得多糖百分比含量预测值对编码自变量加热温度、加热时间、液料比和NaOH 浓度的二次多项回归方程:

上式中，Y 为多糖百分比含量的预测值，A，B，C 和D 分别为加热温度，加热时间，液料比和NaOH 浓度的编码值．

2．4 响应曲面法优化工艺

2．4．1 双因素交互作用分析［11］回归方程的方差分析结果见表4．由方差分析表可知，本试验所建立的提取数学模型中AB、AD、BD 的交互影响较小，只有AC、BC、CD 的交互作用显著，即加热温度和液料比之间的交互作用对碱溶性多糖提取率有显著影响，加热时间和液料比之间的交互作用对碱溶性多糖提取率有显著影响，液料比和NaOH浓度之间的交互作用对碱溶性多糖提取率有显著影响，它们交互作用响应曲面分别如图6、图7 和图8．

图6 加热温度和液料比交互作用影响Fig．6 The interaction effects of heating temperature and solvent－material ratio

图7 加热时间和液料比交互作用影响Fig．7 The interaction effects of heating time and solvent－material ratio

图8 NaOH 浓度和液料比交互作用影响Fig．8 The interaction effects of NaOH concentration and solvent－material ratio

从图6 可以看出，当加热温度一定时，液料比在22 至30 之间变化，碱溶性多糖的含量先是显著增大，但到达一定值时，又开始慢慢减小;当液料比一定时，加热温度在80℃至90℃之间变化，碱溶性多糖的含量先是渐渐增大，但到达一定值时，又开始慢慢减小．从图7 可以看出，加热时间和液料比的交互作用影响与加热温度和液料比交互作用影响是非常相似的． 同样，从图8 也可以看出，NaOH 浓度和液料比的交互作用影响与加热温度和液料比交互作用影响是非常相似的．

2．4．2 各因素的影响程度分析 各因素的F 值可以反映出各因素对试验指标的重要性，F 值越大，表明对试验指标的影响越大，即重要性越大．从方差分析表可知:FA=30．73，FB=0．03，FC=4．15，FD=2．38，即各因素对碱溶性多糖提取率的影响程度大小顺序为:加热温度﹥液料比﹥NaOH 浓度﹥加热时间．

2．4．3 提取条件的优化 由所建立的数学模型进行参数最优化分析，得出碱溶性多糖提取含量最高的参数条件为:液料比27．12 mL/g、浸提温度90℃、浸提时间4．98 h、NaOH 浓度3．23 mol/L．此优化工艺下碱溶性多糖百分含量的预测值为52．19%，验证实验中实际测得碱溶性多糖提取率为48．97%．

3 结论

响应曲面法提取欧李种壳的碱性多糖，根据单因素试验分析，选择了加热时间、加热温度、液料比和NaOH 浓度为自变量，多糖百分含量为响应值，运用响应面法(RSM)建立了提取工艺条件多元二次模型，能有效预测工艺的多糖百分含量．得到优化的提取工艺条件为:加热温度90℃，加热时间4．98 h，液料比27．12 ml/g，NaOH 浓度3．23 mol/L．按此提取工艺，提取出来的多糖百分含量为48．97%．从欧李种壳中提取碱溶性多糖的工艺简单，能在常规条件下进行，且提取的多糖含量较多．因此工业生产从欧李种壳中提取多糖很有经济价值．

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