甲胎蛋白异质体3、高尔基体蛋白73及热休克蛋白27在原发性肝癌中的诊断价值

黄琳淋 李光迪

兰州大学第二临床医学院，甘肃兰州 730030

原发性肝癌（primary liver cancer）是我国常见的消化系统恶性肿瘤，由于起病隐匿，发展迅速，确诊时多数患者已经处于癌症晚期，治疗效果不佳，死亡率高，每年有100 万肝癌新患者，有11万人死于肝癌，其全球发病率和死亡率分别列所有肿瘤的第5位和第3位[1]，发病率最高的国家大多在亚洲，其次在非洲等欠发达国家，大洋洲国家较低，美洲国家最低，且男性发病率高于女性，在我国，根据全国三次死亡回顾调查结果（1973-1975年；1990-1992年；2004-2005年） 肝癌在全部恶性肿瘤中的死亡顺位分别为第3位、第2位、第2位，而农村地区发病率高于城市地区[2]，东南高于西北、华北和西南地区，东南沿海高于内陆[1]，严重威胁了人们的健康。目前除了影像学检查外，肝癌的诊断和筛查主要依靠甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP），根据《2011年原发性肝癌诊疗规范》：对于AFP≥400 ug/L 超过1个月，或是≥200 ug/L持续2个月，排除妊娠、生殖腺胚胎癌和活动性肝病，就高度怀疑肝癌。但是AFP 对诊断肝癌的敏感性不高，只有30%～60%[3]，且在其他一些肿瘤患者中也有发现AFP 异常增高。因此，AFP 对于诊断原发性肝癌的应用十分受限。近年来，有学者通过大量的电泳实验发现，原发性肝癌血清中都存在高尔基体蛋白73（GP73）、甲胎蛋白异质体3（AFP-L3）及热休克蛋白27（HSP27），该研究通过定量检测原发性肝癌、肝转移癌、胃癌中三种蛋白的表达情况，并与甲胎蛋白做对比，为探讨它们在原发性肝癌中的诊断价值,现对甘肃省兰州大学第二医院2011年10月—2012年5月住院患者及健康体检者进行回顾性分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该研究共收集血清标本98例，来自甘肃省兰州大学第二医院2011年10月—2012年5月住院患者及健康体检者，男60例，女38例，年龄24～77岁，中位数为52.5岁，其中原发性肝癌36例，肝转移癌14例，胃癌20例，健康对照28例。原发性肝癌、肝转移癌、胃癌患者均为治疗前抽血，健康对照组排除了肝炎患者，肝功、肾功异常者。疾病诊断符合2011版“原发性肝癌诊疗规范”。

1.2 主要试剂及仪器

GP73 酶联免疫试剂盒，AFP-L3 酶联免疫试剂盒，HSP27 酶联免疫试剂盒；model AT-858型自动酶标分析仪；Roche cobas 6 000 电化学发光仪。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集 抽取待测者清晨空腹静脉血3 mL，室温静置2h，3 500 r/min，离心10 min。分离血清置-50 ℃冰箱保存。

1.3.2 GP74、AFP-L3、HSP27 测定 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定，严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.3 AFP 测定 采用Roche 发光试剂上机（Roche 2010 化学发光）定量检测。

1.4 统计方法

采用SPSS 17.0 进行统计学分析。多组血清标本检测呈偏态分布，用中位数（95%参考范围）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis 检验，两两比较采用Mann-Whitney 检验。

图1 AFP-L3 在各组中的表达情况

2 结果

2.1 各组血清标本AFP-L3、GP73、HSP27 的检测结果及比较

2.1.1 各组的检测结果 肝癌组、肝转移癌组、胃癌组、正常对照组血清标本AFP、AFP-L3、HSP27、GP73 的表达水平（中位数及95%参考范围），见表1。

2.1.2 各组间数据的总体比较 总体比较经Kruskal-Wallis 检验显示，原发性肝癌组、肝转移癌组、胃癌组、对照组间AFP-L3、HSP27、GP73 三种蛋白含量不全相同，差异有统计学意义（P<0.05（Chi-Square值：AFP-L3：62.862；HSP27：64.367；GP73：62.462）；原发性肝癌组的三种蛋白平均秩次明显高于其他组。见图1,2,3。

图2 HSP27 在各组中的表达情况

图3 GP73 在各组中的表达情况

表1 三种蛋白在各组标本中的表达水平

2.1.3 Mann-Whitney 检验两两比较 原发性肝癌组中AFPL3、HSP27、GP73 分别与其他三组比较，差异有统计学意义，结果如下，AFP-L3(U=3，Z=-5.38，P<0.05；U：48，Z=5.335，P<0.05；U=0，Z=-6.821，P<0.05），HSP27 （U=4，Z=-5.359，P<0.05；U=29，Z=-5.660，P<0.05；U=0，Z=-6.821，P<0.05）,GP73 （U=4，Z=-5.359，P<0.05；U=45，Z=-5.386，P<0.05；U：0，Z=-6.821，P<0.05）。肝转移癌组、胃癌组及正常对照各组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 AFP-L3、GP73、HSP27 在原发性肝癌中的诊断价值

以各组三种蛋白水平绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC 曲线）。AFP-L3 诊断原发性肝癌的曲线下面积为0.977，HSP27 诊断原发性肝癌的曲线下面积为0.985，GP73 诊断原发性肝癌的曲线下面积为0.978。AFP 在临界值为400 ng/mL时，诊断原发性肝癌的灵敏度为66.7%,特异度为96.7%。

2.3 AFP-L3、HSP27、GP73 与AFP 间的相关性分析

实验时发现AFP-L3、HSP27、GP73 三种蛋白颜色的深浅与AFP的含量有明显关系，为验证是否具有相关性，采用Spearman检验，AFP 与AFP-L3、HSP27、GP73 的相关水平分别为：0.896、0.853、0.838，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4 AFP-L3、HSP27、GP73 与乙肝表面抗原的相关性分析

原发性肝癌患者乙肝表面抗原表达情况为26例表面抗原阳性患者，10例表面抗原阴性患者，采用Spearman 检验，乙肝表面抗原（HBV-SAg）与AFP-L3、HSP27、GP73 的相关水平(r)分别为：0.119、0.176、0.176，双侧检验P值分别0.488、0.304、0.304，差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

当前，诊断原发性肝癌的实验室指标主要依靠甲胎蛋白（AFP），但其灵敏度、特异度有限，学者们通过各种方法寻找原发性肝癌的特异指标，其中甲胎蛋白异质体（AFP-L3）、高尔基体蛋白73（GP73）、热休克蛋白27（HSP27）是近年来的研究热点。

根据AFP 分子存在糖链异质性，通过凝集素亲和电泳可把AFP 异质体分成3个条带，依据电泳迁移率大小，依次命名为AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3。AFP-L1 在良性肝病中占主要部分；AFP-L2 来自孕妇；AFP-L3 是由肝癌细胞产生[4]，因此AFP-L3的诊断灵敏度和特异度都应高于AFP。高尔基体蛋白73（GP73）是美国学者Kladney 发现的一种新的跨膜糖蛋白，在正常肝脏中，GP73 主要是在汇管区的胆管上皮细胞中表达，在其他肝细胞中不表达表达或是表达微弱[5]。有学者[6]分析肝癌患者血清中GP73 的灵敏度和特异度，都明显好于AFP，在肝转移癌组中尤为明显。赵建忠[7]等应用酶联免疫试剂盒检测GP73，研究发现，与AFP-L3 相比，原发性肝癌组具有更高的GP73 阳性率，而在肝硬化和肝炎组中GP73 的阳性率低于AFP-L3，因此血清中GP73 含量可能是比AFP-L3 更好的一个分子标志物。热休克蛋白27（HSP27）是低分子量热休克蛋白家族成员，与药物的抗性，细胞生长、凋亡，肿瘤的发生，转移等功能密切相关的蛋白质，保护细胞免受应激损伤，参与细胞增殖分化，抑制细胞凋亡，参与癌症的发生,在细胞凋亡时表达增加等，与肿瘤的恶性程度及预后有关[8-10]。Feng 等[11]结合了2-DE 和MALDI-TOF-MS/MS，分析了正常人、乙肝患者、HCC患者，鉴定出了8种差异蛋白，包括甲胎蛋白、热休克蛋白27、丛生蛋白等，通过进步一蛋白免疫印迹验证，HSP27 存在于90%HCC 中。

该研究结果显示，AFP-L3、GP73、HSP27 在原发性肝癌中表达明显高于肝转移癌组、胃癌组及正常对照组，为评价三种蛋白对原发性肝癌的诊断价值，特做了ROC 曲线，HSP27 的曲线下面积最大。与甲胎蛋白相比，三种蛋白的诊断价值优于甲胎蛋白。由于只选择了肿瘤标本，未选择活动性肝炎、生殖系统肿瘤等AFP 出现假阳性的标本，引起本试验特异度较高。该研究提示，AFP-L3、GP73、HSP27 与AFP 存在明显的相关性，与某些研究不一致[12]，这可能与实验方法有关，这有待进一步的研究证实。其次，AFP-L3、GP73、HSP27 与乙肝表面抗原无明显相关，即是患者否患有乙肝对三种蛋白的原发性肝癌的诊断无明显影响。

总之，甲胎蛋白异质体、高尔基体蛋白73、热休克蛋白27 是诊断原发性肝癌的优秀的候选血清标志物，阳性率高，特异性好，操作简单易行，在诊断原发性肝癌中具有较大的应用价值，研究前景广阔。

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