核迁移试验在香菇交配型分析中的应用

李安政,林芳灿

(1.湖北中医药大学 医学生物技术研究所，湖北 武汉 430065;2.华中农业大学 应用真菌研究所，湖北 武汉 430070 )

核迁移试验在香菇交配型分析中的应用

李安政1,林芳灿2

(1.湖北中医药大学 医学生物技术研究所，湖北 武汉 430065;2.华中农业大学 应用真菌研究所，湖北 武汉 430070 )

在四极性的担子菌香菇中，由于没有明确的形态差异，交配型分析中两种不亲和反应即A=B≠和A≠B=，难以相互区别.在利用原生质体单核化对5个供试香菇菌株进行常规交配型分析的基础上，采用核迁移试验对各菌株孢子单核体的交配型组合进行了鉴定.结果表明，5个菌株中有4个菌株观察到核迁移现象，核迁移仅出现于A=B≠反应中而不出现于A≠B=反应中.总的说来，由于该方法通常可清楚区分A=B≠和A≠B=反应，因此，用于香菇交配型因子的准确鉴定是行之有效的.

香菇；交配型；核迁移试验；标准测交菌株

香菇(Lentinulaedodes)是一种食药用真菌，也是世界三大栽培蕈菌之一[1].作为一种异宗结合的四极性担子菌，香菇的交配系统由两个非连锁的A、B交配型因子所控制，它们的子实体产生4种交配型 (AxBx,AyBy,AyBx,AxBy)的有性孢子；只有两对因子均不相同的组合即AxBx+AyBy或AyBx+AxBy，才能正常结实并完成整个有性生活史[1-2].

在四极性担子菌交配型分析的常规程序中，要点是要从供试单孢中找到代表四种交配型的标准测交菌株(T1、T2、T3和T4)[3-4]，因而通常需要随机挑选一定数量的单孢(如20个以上)进行两两配对[5]，工作量较大.原生质体单核化技术[6]的出现，为交配型的鉴定提供了更可靠而简便的方法：标准测交菌株T1、T2，可以直接利用该技术从供试单孢的亲本双核体获得.

通过交配型分析的常规程序，可以明确的是T1和T2之间、T3和T4之间均是A≠B≠；而对T1与T3、T1和T4、T2与T3、T2和T4间的关系，只可能知道有一个交配型因子相同，具体是哪个交配型因子相同却难以区分.为进行交配型因子的深入研究，或在分子生物学研究中要建立不同交配型的基因池时，需要对四种类型的担孢子的交配型进行准确鉴定.

已知四极性蕈菌的B交配型因子控制核迁移[6-7]，即只有当B座位处于异等位基因状态时(A≠B≠、A=B≠)，核迁移过程才会发生.可以根据此特点，利用核迁移试验来区分A=B≠和A≠B=，从而对交配型进行准备鉴定.

本研究将在利用原生质体单核化方法对香菇进行交配型的常规分析基础上，试用核迁移试验对4种单孢的交配型进行准确鉴定，为深入研究香菇的交配型因子的结构等方面奠定初步的基础.

1 材料与方法

1.1 供试菌株和培养基

供试香菇野生菌株GAN057、SHX041由野外环境采集；栽培菌株IB15、IB31由河南省科学院生物研究所提供，栽培菌株HL01由华中农业大学菌种厂提供；培养基：PDA(马铃薯，葡萄糖)；CYM(磷酸盐，硫酸镁，葡萄糖，酵母膏和蛋白胨)；MYG(麦芽糖，酵母膏，葡萄糖)；木屑代料培养基，木屑培养基配制参照文献[8-9]所述的方法进行.

1.2 双核菌株的栽培、担孢子的收集及孢子单核体的制备

6月中旬，以玻璃瓶装入木屑代料培养基，高压灭菌2 h，冷却后接种，参照文献[9]所述方法栽培后收获子实体，进行孢子的收集和孢子单核体的制备[9].

1.3 标准测交菌株T1、T2、T3和T4的确定

用原生质体单核化方法对双核菌丝体进行原生质体的制备[4]，将所得的原生质体再生菌株两两配对，以锁状联合的有无作为亲和与否的标准，选出一对可亲和的单核化菌株，分别命名为T1、T2，即为所需的标准测交菌株T1、T2.

将上述标准测交菌株T1、T2与相应的孢子单核体进行配对，从与T1、T2都不亲和的配对中选出部分孢子单核体进行两两配对，再从这些配对中选出一对可亲和的孢子单核体，分别命名为T3、T4，即为所需的标准测交菌株T3、T4.

图1 核迁移试验示意图Fig.1 Representation of testing for nuclear migration

1.4 单核体交配型的鉴定

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用四个标准测交菌株T1、T2、T3和T4与所有的孢子单核体进行配对，镜检配对菌丝锁状联合的有无.根据反应情况确定孢子单核体的交配型.

1.5 核迁移试验准确鉴定交配型

将四组单孢菌株T1、T2、T3和T4每组取数个单核体进行核迁移实验.第一次配对组合有T1×T3、T1×T4、T2×T3和T2×T4等4种组合.两配对块之间相距约2 cm，培养至菌丝交接后，在配对块外侧各取一菌块分别按图1所示与相应单核体进行第二次配对.镜检第二次配对后有无形成锁状联合，以判断有无核迁移现象的发生.凡第二次配对产生锁状联合，表明相应的第一次配对有核迁移发生，其交配反应为A=B≠；凡第二次配对无锁状联合产生，表明相应的第一次配对无核迁移发生，其交配反应为A≠B=.据此即可确定T1与T3之间交配型关系到底是A=B≠还是A≠B=；对应的，T1与T4之间、T2与T3之间、T2与T4之间的关系也可以鉴定出来.

2 结果与分析

2.1原生质体单核体的鉴定及标准测交菌株T1、T2的确定

对5个供试双核菌株，先对相应的子实体进行组织分离培养后得到菌丝，再对菌丝进行原生质体单核化.酶解涂平板后置25℃培养，5 d左右即出现肉眼可见的白色再生菌落.挑取其中直径较小的菌落(生长相对慢，是单核的可能性较大)至PDA试管斜面中继续培养，每天挑取一次，连续挑取(约7 d左右)至平板长满菌丝不能再挑取为止.

对初步挑取到试管斜面的再生菌落菌丝经镜检，无锁状联合的确定为单核体，最终每个双核菌株获得的原生质体再生单核体数量在54～80之间.交配型鉴定结果表明，属于每种双核菌株的原生质体再生单核体均可获得两种交配型(表1).将两种交配型的单核体中一种命名为T1，一种命名为T2；指定T1的交配型为AxBx，则T2的交配可定为AyBy.T1、T2即为需的标准测交菌株.

表1 5个双核菌株获得的原生质体单核体比例Tab.1 Ratio of protoplast monokaryons from 5 dikaryon strains

表2 4种类型单孢交配型鉴定结果

2.2标准测交菌株T3、T4的确定及孢子单核体交配型常规分析

每个双核菌株后代单孢与相应的四个标准测交菌株进行交配鉴定，将配对反应中仅分别与T2、T1、T4和T3亲和的单孢分别归为T1组、T2组、T3组和T4组，从而将相应的单孢分为四种类型.其中T1组、T2组的交配型分别为AxBx、AyBy；指定T3组的交配型为AxBy，则T4组的交配型为AyBx.

2.3四类孢子单核体菌株交配型的准确鉴定

2.3.1 核迁移试验与交配型的准确鉴定 5个供试香菇菌株中，初始指定T1、T2的交配型分别为AxBx、AyBy；T3的交配型为AxBy、T4的交配型为AyBx.经核迁移试验，确定了2株(IB15,SHX041)的交配型与初始指定的一致，即T1、T2、T3和T4的交配型分别为AxBx、AyBy、AxBy和AyBx；确定了2株(IB31，GAN057)的T3、T4交配型分别为AyBx、AxBy，与初始的指定刚好相反.较特殊的是HL01，在其核迁移试验中未获得预期结果，第二次配对中所有的配对组合均未发现锁状联合.

2.3.2 交配型鉴定结果 通过核迁移试验，最终鉴定出了各组单核体的准确的交配型(表2).对HL01菌株，用培养基转换法[10]鉴定T1、T2、T3和T4的交配型分别为A1B1、A2B2、A2B1，和A1B2.

3 讨论

核迁移试验的理论基础在于B因子的特定功能.实验结果表明，正如真菌遗传学所预期的那样，在四极性异宗结合菌中，只有A≠B≠或A=B≠即B因子不相同的配对才会发生核迁移.因此两个交配结果同为不亲和的配对，根据第二次配对锁状联合的有无即核迁移是否发生，可以对二者哪一个是A=B≠，哪一个是A≠B=，作出清楚的判别.值得注意的是，在供试5个菌株的核迁移试验中，HL01菌株的结果出现异常，其第二次配对中所有的配对组合均未出现锁状联合.这是因为该菌株在异核化的部位、范围、稳定性等方面属不规则类型[11]，还是有其他未知因素妨碍了鉴定的正常进行，有待进一步研究.

在担子菌的交配型分析中，最可靠的方法是两两配对法.但在样本容量很大时该方法的工作量也显著增大.如本研究中HL01的189个后代单孢菌株如按此方法进行交配型的鉴定需C1892=17766个配对.而用标准测交菌株法，理论上只需189×4=756个配对，极大的减少了鉴定工作量.标准菌株法的至关重要的一点是要求四个标准测交菌株绝对准确、可靠.采用原生质体单核化的方法，可以准确获得与亲本双核体交配型相同的T1(A1B1)、T2(A2B2)两种标准测交菌株.

在香菇中，由于没有明确的形态差异，两种不亲和反应即A=B≠和A≠B=，难以相互区别.在对四极性蕈菌常规交配型分析过程，测交菌株T3的选择是随机的，其交配型既有可能是AxBy也有可能是AyBx[4].在对大量单核体的交配型因子进行鉴定时，势必会遇到各种不亲和反应彼此难以区分的问题.此时，在常规交配型分析的基础上，增用核迁移试验进行深入研究，对提高研究结果的准确性，将大有助益.除了在遇到在发生部位、范围等方面不太规则的核迁移时应注意对结果进行审慎的分析和验证之外，总的来说，在交配型因子鉴定中，核迁移试验不失为一种更便捷而准确的研究手段.

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TheMatingTypeAnalysisinLentinulaEdodesUsingNuclearMigrationTest

LI An-zheng1,LIN Fang-can2

(1.Institute of Medical Biotechnology, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China; 2.Institute of Applied Mycology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

During the mating type analysis of the tetrapolar basidiomycetesLentinulaedodes, It is difficult to distinguish mating reactons betweenA=B≠ andA≠B= due to the lack of definite morphological differences. In this study, based on the regular mating type analysis of 5L.edodesstrains by means of protoplasting monokaryotization, the nuclear migration test was used for identification of mating type factors of monkaryons derived from each of these strains. The result showed that, using this method, 4 out of the 5L.edodesstrains occurred nuclear migration. The nuclear migration occurred only inA=B≠ but not inA≠B=.Therefore the nuclear migration test can usually discriminate definitely mating reactions betweenA=B≠ andA≠B=, and it is a effective method for exactly identification of mating type factors ofL.edodes.

Lentinulaedodes; tetrapolar; mating type analysis; standard tester strain

2013-08-29.

国家自然科学基金项目(30170024).

李安政(1972- )，男，博士，讲师，主要从事蕈菌遗传及生物技术研究.

S646.1+2；Q344+

：A

1008-8423(2013)03-0289-03