肉制品中沙门氏菌invA基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

杜雄伟，李 叶，冮 洁，胡文忠，武晓松

（1.大连民族学院，辽宁大连116600；2.辽宁出入境检验检疫局，辽宁大连116001）

沙门氏菌是一种重要的食源性致病菌。由沙门氏菌引起的食物中毒事件在世界各国频频报道。2007年2月，美国发生的“花生酱事件”，2005～2006年间，美国发生的“番茄事件”均是因沙门氏菌引发[1-3]。2006年卢森堡公国，沙门氏菌引起133人食物中毒，1人死亡[4]。2005年6～10月之间，澳大利亚塔斯马尼亚州爆发了5次沙门氏菌引起的食物中毒，感染125人[5]。2005年法国因牛奶引起的沙门氏菌中毒事件，同时感染100多婴儿[6]。1990～2003年间西班牙加泰罗尼亚地区，共爆发1078次食物中毒，其中因沙门氏菌引起为871次，14695人感染，1534人住院治疗，4人死亡，所占比例高达80.8%[7-9]。在我国，细菌性食物中毒中有70%～80%是由沙门氏菌引起的，以沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的首位[10]。由上可见，食品行业沙门氏菌的检测尤为重要，现有检测方法主要为生化鉴定和常规PCR方法，这些方法耗时耗力，荧光定量PCR方法具有快速准确、敏感性强的特点。国外已经开发了类似的快速检测试剂盒，但由于知识产权的限制，使用起来极为不便，并且费用昂贵。因此自主建立特异、敏感、快速的沙门氏菌快速检测方法对沙门氏菌防控显得尤为重要。实时荧光定量PCR以其特异性强、灵敏度高、速度快，在病原菌检测中得到广泛应用。本研究以沙门氏菌invA基因为靶基因，应用SYBR Green荧光定量PCR技术建立特异快速的沙门氏菌检测方法，为沙门氏菌的检测奠定基础[11-12]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙门氏菌C77-31 购于中国兽药监察所；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 本实验室分离保存；野生型鼠白血病病毒反转录酶（Reverse Transcriptase M-MLV）、RNA酶抑制剂（Ribonuclease Inhibitor，Rnasin）、Dnase-1、Ex-TaqDNA聚合酶（Ex-Taq Polymerase）、Taq DNA聚合酶（5U/μL）、dNTPs（100mmol/mL）、DL2000 DNA marker、Light Cycler2 FastStart DNA master SYBR GreenⅠ试剂盒、一对特异性引物InvAF、InvAR宝生物工程（大连）有限公司产品；质粒快速提取试剂盒及DNA纯化试剂盒 Omega公司产品；总RNA提取TRIZOL Reagentinvitrigen公司产品；常规试剂 均为分析纯。

7500型实时荧光定量PCR仪、ABI System 9700型常规PCR扩增仪 美国ABI公司；凝胶成像分析系统 美国UVP GelDoc-lt公司；高速离心机 美国Eppendorf公司；恒温摇床 美国Barnstead Lab-Line公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物的设计 根据GenBank中已经注册的沙门氏菌invA基因序列，用引物设计软件Prmier5.0设计一对特异性引物InvAF、InvAR，引物序列如下：

InvAF：5’-TCATTCCATTACCTACCTATC-3’

InvAR：5’-AGAA（G/A）ACAACAAAACCCAC-3’

1.2.2 PCR模板的制备 所有受试菌接种于3mL LB肉汤中，37℃培养至OD600为0.5，再调节细菌浓度为1×107CFU/mL，取1mL，10000r/min离心2min，收集菌体。菌体用灭菌超纯水洗涤，1000×g离心5min，弃上清，用200μL的灭菌超纯水重悬菌体，加入等体积的消化缓液及5μL的蛋白酶K（20mg/mL），50℃消化2h，12000r/min离心15min；将上清转移到新的1.5mL的eppendorf管中，加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒均匀，12000r/min离心15min；取上层的水相转入新的1.5mL的eppendorf管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）混匀后，在离心机上12000r/min离心15min；酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）重复抽提一次；取上层的水相转入新的1.5mL的eppendorf管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，在-20℃放置l～2h或室温放置30min以沉淀细菌DNA；12000r/min离心15min，弃去上清，用70%乙醇洗涤沉淀，自然风干。用含RNAseA（20μg/mL）的TE溶解沉淀，-20℃保存备用。

1.2.3 常规PCR（25μL PCR）反应体系 10×PCR buffer（含Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mmol/μL）0.5μL，InvAF（20pmol/μL）0.5μL，InvAR（20pmol/μL）0.5μL，1.2.2.1产物0.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，DEPC水20μL；反应程序为94℃，2min；98℃ 15s，54℃15s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。取5μL PCR产物1%于琼脂糖凝胶电泳。

1.2.4 标准阳性模板的制备 将1.2.2.2中PCR产物回收纯化后，插入pMD18-T载体，命名为pMD18-T-invA，转化于DH5α大肠杆菌中，PCR、测序鉴定。

1.2.5 标准曲线的建立 20μL反应体系，SYBR GreenⅠ10μL，DryII 0.4μL，InvAF（20pmol/μL）0.4μL，InvAR（20pmol/μL）0.4μL，1.2.2.1产物 2.0μL，无菌三蒸水6.8μL；反应程序为95℃ 2min；95℃ 15s，58℃ 20s，72℃ 30s，80℃ 35s，30个循环；95℃ 15s，60℃ 2min，95℃15s。反应结束后，ABI7500型荧光定量PCR扩增仪自动记录结果。

将正确的重组的标准参照物（质粒）以10倍的倍比关系作一系列稀释，以不同稀释浓度的标准参照物作为模板，用所设计的引物进行荧光定量PCR扩增，以浓度的对数和相应的阈值循环数（Threshold cycle，Ct）为相应的X轴、Y轴制作标准曲线。

1.2.6 特异性检测 用所设计的invA引物对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的纯培养物菌液的基因组DNA进行荧光定量PCR，以验证所选引物的特异性。反应条件同1.2.3。

1.2.7 敏感性检测 取沙门氏菌培养液，作10倍比稀释，琼脂平板培养计数法测定浓度，并取不同浓度稀释液，进行荧光定量PCR扩增，确定检测下线测定。

1.2.8 重复性检测

1.2.8.1 组内重复性 对同一样本DNA设置20管，同时上机进行荧光PCR重复性的检测。

1.2.8.2 组间重复性 重组质粒10倍递增稀释样本检测后置于-20℃保存30d后重新进行荧光PCR检测。

2 结果与分析

2.1 沙门氏菌invA基因PCR扩增与测序

常规PCR（图1）中明显可见约188bp大小片段，结果与预期大小一致，PCR扩增产物连接在pMD18-T载体上，命名为pMD18-T-invA。

图1 invA基因PCR扩增电泳图Fig.1 The electrophoretogram of PCR amplification of invA gene

扩增片段测序结果为：TCATTCCTTACCTACCTA TCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTACT GGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGA CAGAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGGTACT GTTAATTACCACGCTATTTCGTCTGGCATTATCGAT CAGTACGAGGAGGTGGTGGGGTTTGT。

2.2 invA基因荧光定量标准曲线的建立

2.2.1 扩增动力学曲线 将invA基因重组质粒以10倍的倍比关系作一系列稀释，当重组质粒DNA稀释度在10-2～10-8时，具有较好的线性关系，10-3、10-4、10-5、10-6四浓度摸板扩增后的动力学曲线见图2。

图2 invA基因扩增动力学曲线Fig.2 Amplification curve of invA

2.2.2 invA基因荧光定量标准曲线 图3中，横坐标为各基因重组质粒梯度稀释对应拷贝数的对数值，纵坐标为达到荧光域值所需的反应循环数即阈值循环数（Threshold cycle，Ct）。invA基因重组质粒的标准曲线为：y=-3.24x+32.73，相关系数r2分别为0.9981，标准曲线斜率为-3.24。

图3 invA基因标准曲线Fig3 Standard curve of invA

2.3 荧光定量PCR的特异性

对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行荧光PCR检测，只有沙门氏菌出现特异性扩增，其他相关病原（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）并未有扩增，表明本方法特异性良好。

2.4 荧光定量PCR的敏感性

琼脂平板培养计数法测定沙门氏菌培养液浓度，10倍梯度稀释，取不同浓度稀释液，进行荧光定量PCR扩增，结果显示其检测下线为101CFU/mL。

2.5 荧光定量PCR的重复性

2.5.1 组内重复性 对同一样本设置20管重复同时检测，结果见表1，CT值变异系数为0.96%。说明组内重复性良好。

表1 组内重复性实验Table 1 Repeatability test in the group

2.5.2 组间重复性 隔30d检测同一样本10倍稀释后检测，结果见表2，经成对数据平均数比较假设检验，无显著差异（p≤0.01）。

表2 组间重复性实验Table 2 Repeatability test between groups

3 结论与讨论

引物直接影响到方法的特异性与灵敏度。由于invA基因较长，具有许多重复序列，为引物的设计增加了难度。为了保证该方法的特异性，从GenBank上下载了大量invA基因序列，通过文献及序列比较，设计了该基因的引物。为保证方法的灵敏度和扩增效率，获得检测最低Ct值和最高荧光强度值，在前期对荧光定量PCR方法Mg2+浓度、引物、探针浓度和Tm温度优化的基础上，本研究建立了检测肉制品中沙门氏菌的荧光定量PCR方法，同时也进行了一步荧光定量PCR实验。

本研究建立了一种快速、敏感、准确检测肉制品中沙门氏菌的SYBR Green实时荧光定量PCR方法。该方法从核酸提取至检测完成，仅需3h左右，且实行完全闭管式操作，从根本上杜绝了常规PCR扩增产物污染和假阳性的问题。经过大量的临床验证表明，该检测方法敏感、特异，操作方便简单，花费时间短，适用于临床样品的检测。今后的研究方向应放在用酶颗粒代替各种酶成分[13-14]，该方法特异敏感，避免了再污染，具有广阔的临床应用前景。

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