竹叶青素的基因合成、原核表达及生物学功能的初步研究

齐元麟，张明芳，胡建石，徐剑文，林建银

(福建医科大学1.基础医学院分子医学研究中心，消化道恶性肿瘤教育部重点实验室，2.生理学与病理生理学系，3.人体解剖学与组织胚胎学系，福建 福州 350004)

整合素(integrin)是细胞膜上一类重要的跨膜糖蛋白，介导细胞间及细胞-基质间的黏附，控制细胞的增殖、凋亡和分化，而影响胚胎发育、创伤愈合及肿瘤生成和转移等过程［1-2］。去整合素(disintegrin)是蛇毒中一类含有RGD模体的多肽，能阻断整合素与配体的结合，具有抑制血小板聚集、抑制骨吸收及抑制肿瘤转移与血管新生等生物学功能［3-5］，其药物开发潜力引起关注［6-8］。

本研究选择来自竹叶青(Trimeresurus stejnegeri)的trigramin(竹叶青素)作为研究对象，合成竹叶青素基因并在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定，同时从竹叶青蛇毒中分离纯化天然竹叶青素作为对照，为研究蛇毒去整合素生物学活性和可能的开发应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人膀胱癌细胞株ECV304由本实验室保种，培养条件为:含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃和5%CO2饱和湿度培养。

1.2 主要试剂 竹叶青蛇毒，淡黄色冻干粉，产地:江西;胎牛血清，杭州四季青公司;DMEM培养基、青链霉素，Invitrogen公司;BL21工程菌、pET-42a载体、BugBuster HT、rLysozyme、还原型谷胱甘肽，罗氏公司;Spe I、Xho I限制性内切酶，New England Biolabs公司;CCK-8试剂盒，同仁化学研究所;GSTrap FF亲和层析柱、Sephacryl S-300分子筛层析柱，GE Healthcare公司;Lichrospher C18层析柱，Merck公司。其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.3 竹叶青素全基因合成 将竹叶青素Trigramin序列(NCBI accession number:X51530.1)分为相互重叠的4个片段，分别合成相应寡核苷酸A、B、C、D，并设计相应引物 ABF、ABR、CDF、CDR。取 A、B、ABF、ABR 各10 pmol加入1×PCR Buffer中，100℃变性2 min，在2.5 h内缓慢退火至37℃，然后加入Taq酶，常规PCR扩增拼接AB片段。如法拼接CD后，利用合成的AB和CD片段进一步拼接完成全序列。产物进一步克隆入pUC19载体，并经测序验证。引物序列见Tab 1。

Tab 1 List of primers for gene synthesis

1.4 竹叶青素的原核表达 将Trigramin从pUC19载体亚克隆到pET-42a表达载体的Spe I和Xho I位点，抽提质粒，转化工程菌BL21，筛选单克隆接种至摇瓶，以2.5 mmol·L-1IPTG诱导蛋白表达。Phoretid 1D软件分析蛋白相对表达量。

1.5 重组竹叶青素的纯化 重组竹叶青素转化菌和空质粒pET-42a转化菌经IPTG诱导4 h后，离心收集细菌沉淀并称重，加入BugBuster HT裂解细菌(每克菌体加入5 ml试剂)，同时加入溶菌酶(rLysozyme)至终浓度1 kU/ml，温和裂解，去除沉淀，上清液上样于GSTrap FF亲和层析柱，以Tris缓冲液(50 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1还原型谷胱甘肽)洗脱目的蛋白。

1.6 天然蛇毒中竹叶青素的分离纯化 竹叶青粗毒0.5 g溶于5 ml 0.05 mol·L-1的Tris缓冲液(pH 8.0)，16 000×g离心15 min，弃去不溶的沉淀，取上清液上样于Sephacryl S-300预装柱(2.6 cm×60 cm)，在AKTA prime纯化系统上进行凝胶过滤层析。将分子筛分离得到的具有抑制血小板聚集活性的组分上样于Lichrospher C18 4.6/250反相色谱柱，经两次反相高效液相色谱分离，得到纯化的竹叶青素。SDS-PAGE鉴定蛋白均一性。

1.7 血小板聚集实验 人的静脉血样采自健康志愿者的肘前静脉，离心法制备富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。用PPP稀释PRP使血小板终浓度为3×108·L-1。在200 μl PRP中分别加入不同浓度的天然或重组竹叶青素，在MPG-3E血液凝聚仪中测定血小板聚集率。计算抑制率的公式如下:

绘制剂量-效应曲线，求得半数抑制浓度(IC50)，IC50定义为聚集受抑制达到最大值的一半时的竹叶青素的终浓度。

1.8 细胞增殖实验 取对数生长期的细胞，制成单细胞悬液(1×108·L-1)，接种至96孔板，每孔100 μl，每组细胞设5个复孔。37℃和5%CO2实验条件下常规培养。对照组为完全培养基，Trigramin组、GST-Control组和GST-Trigramin分别为含10 mg·L-1天然竹叶青素、100 mg·L-1GST对照蛋白和100 mg·L-1重组竹叶青素的完全培养基，d 1、2、3、4、5分别取出一块板检测，每孔加入 CCK-8 10 μl，37℃培养1 h后，酶标仪上检测450 nm处的光吸收度，绘制细胞生长曲线。

1.9 细胞划痕实验 用250 μl/well的Fibronectin(10 mg·L-1)包被24孔培养板，37℃孵育2 h，超净台风干1 h，每孔加入250 μl含0.1%BSA的无血清培养液，37℃孵育1 h。将常规传代的细胞消化洗涤后，以每孔2×105个的密度接种入包被好的24孔板，细胞融合后换成无血清培养基培养12 h，使细胞同步化。用移液器吸头沿培养板底部呈“一”字型划痕，镜下记录划痕区相对距离，PBS轻轻洗涤两次以去除细胞碎片，无血清培养液洗涤后，更换含2%血清的培养基(实验组分别为含2%血清的10 mg·L-1天然竹叶青素、100 mg·L-1GST对照蛋白和100 mg·L-1重组竹叶青素)，培养24 h，观察划痕区细胞的生长情况。

1.10 统计学分析 所有数据均采用SPSS软件进行统计学处理，实验数据以±s表示，组间比较采用t检验。

2)暴雨过程MCS的发展有多种组织方式,东西向雨带不断的后部建立型和随后对流单体的列车效应是6月26日夜间到凌晨MCS发展的主要方式。27日凌晨到早晨,对流元向东北—西南向发展形成多个近乎平行的东北—西南向雨带,有2种尺度的对流组织方式:一种是新生对流单体沿着每个雨带向东北方向移动的列车效应,另一种是雨带沿着线状MCS向东平流的“列车带效应”。27日白天,梅雨锋锋面雨带中东北—西南向短雨带的不断东移是降水持续的原因。

Fig 1 Gene synthesis and E.coli expression of snake venom disintegrin Trigramin

2 结果

2.1 竹叶青素基因合成及原核表达 采用缓慢退火-PCR方法，将片段引物拼接成完整的竹叶青素基因，并克隆入pUC19载体，经测序验证无误。将基因亚克隆至原核表达载体pET-42a，在BL21菌株中用IPTG诱导表达，空白质粒转化组表达出GST对照蛋白(38.5 ku)，重组竹叶青素转化组表达出融合蛋白GST-Trigramin(35.9 ku)，而未诱导组在相应位置无表达，蛋白表达量占菌体总蛋白比例分别为31.5%(GST对照)与40.7%(Trigramin)，见 Fig 1。

2.2 重组竹叶青素的纯化和鉴定 BugBuster抽提到的菌体可溶蛋白经亲和层析纯化后，对照蛋白在38 ku、重组蛋白在36 ku附近呈现出一条蛋白主带，与GST对照蛋白及GST-Trigramin融合蛋白的大小一致，纯度分别为83.2%和89.1%。见Fig 2。

2.3 天然竹叶青素的纯化和鉴定 竹叶青蛇毒经Sephacryl S-300分为5个峰，其中Ⅳ峰和Ⅴ峰具有抑制血小板聚集能力，收集Ⅳ峰，经两次反相HPLC分离，得到单一峰。经SDS-PAGE鉴定为均一组分，分子质量为8.5 ku。见Fig 3。

Fig 2 Purification of GST-Trigramin by GST-bind affinity chromatography

2.4 竹叶青素对血小板聚集的影响 天然和重组竹叶青素均可抑制ADP诱导的血小板聚集，且呈明显的剂量-效应关系，而GST对照蛋白不能抑制血小板聚集。天然竹叶青素半数抑制浓度(IC50)为3.0 mg·L-1(0.35 μmol·L-1)，重组竹叶青素的IC50为 28.2 mg·L-1(0.78 μmol·L-1)。见 Fig 4。

2.5 竹叶青素对细胞增殖的影响 10 mg·L-1天然竹叶青素、100 mg·L-1GST对照蛋白和100 mg·L-1重组竹叶青素均不影响ECV304细胞增殖，各组数据统计差异无显著性，见Fig 5。

2.6 竹叶青素对细胞运动的影响 10 mg·L-1天然竹叶青素和100 mg·L-1重组竹叶青素可抑制划痕的愈合，而100 mg·L-1GST对照蛋白不能抑制细胞运动，说明重组竹叶青素抑制细胞运动的功能来自其去整合素结构域。见Fig 6。

Fig 3 Purification of native trigramin from crude venom of Trimeresurus stejnegeri

3 讨论

去整合素在蛇毒中含量甚微，克隆其基因并在各种表达系统中表达重组蛋白，是研究其生物学功能并进一步开发利用的有效手段。本研究首先合成竹叶青素基因，以GST融合蛋白形式在大肠杆菌表达系统中获得高效表达，重组蛋白产量占菌体总蛋白量的37.6%;随后采用亲和层析技术纯化重组融合蛋白，得到了纯度为89.1%的重组 GST-Trigramin，为研究其功能奠定了基础。GST是原核表达中常用标签，它在菌体内高度可溶并能协助融合蛋白的折叠，有助于获取有活性的重组蛋白。Seoane［9］和 Teklemariam［10］分别用 GST 融合蛋白形式在原核体系表达了小盾响尾蛇(Crotalus scutulatus scutulatus)去整合素mojastin和铜头蝮(Agkistrodon contortrix contortrix)去整合素样肽 acocostatin，并探讨了它们诱导肿瘤细胞和内皮细胞凋亡的功能，发现GST融合去整合素在原核表达体系中能够正确折叠并具有生物学活性。

Fig 4 In vitro inhibition of ADP-induced aggregation of normal human PRP by native and recombinant trigramins

Fig 5 Effects of native and recombinant trigramins on ECV304 cell proliferation

Fig 6 Effects of native and recombinant trigramins on in vitro cell motility

本研究显示，重组GST-Trigramin能抑制血小板聚集和细胞迁移，其抑制ADP诱导的血小板聚集的IC50为 0.78 μmol·L-1，而从蛇毒中纯化得到的竹叶青素抑制血小板聚集的IC50为0.35 μmol·L-1，说明重组GST-Trigramin能够折叠成活性结构，但其活性与天然纯化的蛋白有一定差别，其原因可能为①重组竹叶青素不能100%折叠为天然结构，②GST结构域干扰了竹叶青素与底物的结合，但具体机制仍有待进一步研究。本研究进一步探讨竹叶青素对人膀胱癌细胞ECV304增殖和运动的影响，发现天然和重组竹叶青素均不影响肿瘤细胞增殖，但可抑制肿瘤细胞的体外运动能力。Ramos［11］发现特异性抑制αvβ3的去整合素DisBa-01，可抑制黑素瘤转移和bFGF介导的血管新生，Tian等［12］发现去整合素eristostatin可抑制纤粘连蛋白与细胞的结合，而抑制肿瘤细胞的活动能力，竹叶青素抑制细胞运动可能也通过类似的机制。

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