原生质体制备和再生的影响因素

黄磊

【摘 要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。

【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵

酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。

1.菌体菌龄对原生质体制备的影响

微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。

较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。

微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。

2.稳定剂对原生质体制备的影响

原生质体由于剥除了细胞壁，失去其特有的保护作用，细胞对外界环境变的十分敏感，尤其对渗透压。如果把它悬浮在蒸馏水或等渗溶液中，会吸水膨胀并破裂，所以必须在一定浓度的高渗溶液中进行酶解、破壁、才能形成和保持稳定的原生质体。

作为稳定剂的有无机盐和有机物，无机盐稳定剂包括NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2等；有机物中有糖和糖醇，如蔗糖、甘露醇、山梨醇等。无机盐利于原生质体制备，糖类更适于其再生，可能糖溶液黏度大，不利于酶和细胞的分散与作用，而盐对细胞壁降解有促进作用，故能提高制备率却不利于再生。酵母菌原生质体制备和再生时的稳定剂可选用无机盐或糖醇类化合物，无机盐类在促进原生质体再生方面不及糖和糖醇。其原因是：糖及糖醇是大分子物质，阻碍酶与细胞壁充分接触或者防碍原生质体释放，同时，其对原生质体又有保护作用。

各种稳定剂的pH值应保持在一定范围之内，这需要适宜的缓冲液配合使用，以保证酶活性和菌体本身活性维持在一个叫高的水平。稳定剂是一种高渗溶液，但是浓度也不能过高，否则会使原生质体皱缩，一般在0.3-1.0mol/L之间。

概言之，稳定剂的作用，不仅能防止原生质体的破裂，控制并达到最大的数量，而且对提高酶的活性，促进酶和底物的结合都具有相当的优越性。不同的稳定剂对原生质体的释放和保护作用是不同的，一般认为易于渗入质膜和易于被原生质体及菌体分解的物质不宜作为稳定剂。

3.酶解前的预处理对原生质体制备的影响

用酶类来水解细胞壁，首先要使得酶溶液渗透到细胞壁中，但是生物体都具有保护自身的一套严密的结构，不是任何物质都可以随意进入的。为此，在用酶类处理之前，最好根据细胞壁的不同结构和组成加入某些物质先行预处理，以抑制或阻止某一种细胞壁成分的合成，从而使酶易于渗入，提高酶对细胞壁的酶解效果。

适当预处理可在一定程度上破坏酵母菌细胞壁外层大分子高级结构，改善通透能力，促进细胞壁水解酶向内壁层扩散，提高原生质体制备效率，并缩短酶作用时间，降低酶液对形成的原生质体损伤，保持高活性，提高再生率和融合率。其作用主要是这些化合物能还原细胞壁中蛋白质的二硫键后，使分子链切开，酶分子易于渗入，促进细胞壁的水解，易于释放原生质体。

SH-化合物（如β-巯基乙醇）广泛运用于酵母菌中，效果很好。可是，酵母细胞脱壁前，做一些预处理可使原生质化率大大提高，但原生质体再生率会有所降低，这是因为其作用于膜蛋白，造成细胞损伤。酵母菌细胞壁外层由一蛋白鞘构成，预处理剂EDTA 或 EDTA加巯基乙醇能破坏这一结构，利于水解酶渗透进入内壁层并促进其对细胞壁的降解，因此适度预处理后能显著提高原生质体制备率；用EDTA处理细胞，一方面将细胞壁中部分不溶性蛋白质抽提出来，另一方面又通过EDTA与多种金属离子形成络合物，避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶的脱壁效果；用巯基乙醇处理对数期的细胞，以促进蛋白质中的二硫键断裂，松动细胞壁结构，使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加，同时抑制细胞壁的重新合成。至于经预处理后原生质体再生率略低于非处理，但从形成率和再生率双重因素考虑， 使用预处理再生总数高于非预处理。

4.酶系和酶的浓度对原生质体制备的影响

各种微生物由于细胞壁组成不同用于水解细胞壁的酶的种类也不同。而酵母菌的细胞壁组成主要为葡萄糖和几丁质。用于水解的酶类主要有蜗牛酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶等。最常用的是蜗牛酶，它是一种以纤维素酶为主的混合酶，适合水解酵母细胞壁中的多种组分。

制备酿酒酵母原生质体时，一般采用50μl EDTA和5μl巯基乙醇及1%纤维素酶高渗磷酸—甘露醇缓冲液预处理，原生质体的获得率达99%。但在蜗牛酶中复合加入纤维素酶能得到更理想的效果，加快细胞壁水解进程，缩短处理时间，增强所得原生质体活性，并提高再生率。

不同的微生物在制备原生质体时所需酶的种类和酶量均不同，适宜的酶浓度是影响原生质体形成与再生的重要因素，因为酶中往往含有对原生质体有害的酶类（如过氧化物酶、核糖核酸酶等），随着酶量的增加，杂酶的浓度也会随之增加，当达到一定程度时，必然会影响原生质体的活性，降低原生质体的再生率。

总之用于水解细胞壁的酶浓度要适当，酶量过低，作用不彻底，不利于原生质体形成，浓度过高，处理时间过长，会影响原生质体的数量和活性，致使再生率下降。

5.酶的作用温度、时间和作用pH值

同样的培养时间，不同的温度下生长的细胞，其生理状况是有差异的，会影响到原生质体的形成。如酶解温度过高或过低，都会影响酶的活性，使原生质体形成率下降。不同的酶具有各自不同的最适温度，这在水解细胞壁的时候是要首先考虑的。还要注意菌株生长的最适温度，以避免因温度不当而导致原生质体的活性降低，甚至破坏。确定酶解温度的时候以上两者均要兼顾。总的说来，酵母菌的温度要低些，多在38-30℃。

随着时间的增加，原生质体的形成率增加，可能是因为随着时间的增加，细胞壁的水解更为充分的原因。酶解时的最适pH值也随着酶的特性和菌种的特性而异。

6.总结

可见，影响原生质体制备和再生的因素很多，不同酶系统及酶浓度、渗透压稳定剂、酶解温度、时间、不同前处理方法都有较大的影响，选择合适的条件，以期大幅度提高原生质体的形成率，从而为原生质体的诱变育种及融合实验创造更为充分的条件。