烟草疫霉菌对剑麻重要防御酶活性影响的研究

赵艳龙，周文钊，李俊峰，杨玉梅

(中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，广东湛江524091)

剑麻 (Agave sisalana)斑马纹病是危害剑麻最严重的病害，其病原菌主要为烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae van Breda de Haan)［1，2，3］。大量研究表明，超氧化物岐化酶 (SOD)、多酚氧化酶 (PPO)、过氧化物酶 (CAT)是植物体内的重要防御酶，参与活性氧清除及本酚类、木质素和植保素等抗病相关物质的合成，与植物的抗病性密切相关［4，5，6］。关于剑麻保护酶的活性，仅有干旱、盐与低温胁迫条件下的少数几篇报道［7，8］，对酶与剑麻抗病性的关系未见报道，本文以易感病剑麻品种H.11648为材料，在接种烟草疫霉菌前后，分别测定剑麻叶片中SOD、PPO、CAT活性，试图分析病菌对剑麻生理反应的影响，为进一步开展剑麻抗病机制的研究奠定基础，对剑麻抗病育种工作有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

剑麻H.11648盆栽苗，50cm高;烟草疫霉菌由中国热带农业科学院南亚热带作物研究所保存。

1.2 试验方法

1.2.1 接种前酶活性测定

取6株生长基本一致的盆栽苗，其中3株作为对照，3株作为处理。从最下部开始，每株各割取一片完好的叶片，带回实验室，洗净、晾干后，及时测定其SOD、PPO、CAT活性。

1.2.2 接种

将保存的烟草疫霉菌用PDA培养基活化，置于28℃生化培养箱中活化培养7d，作为接种用，从麻苗最下部的叶片开始选择完好叶片全部接种，接种位置距叶片基部10cm，接种时先用75%酒精消毒，刺伤表皮组织，将直径6mm的菌块带菌丝一面贴于伤口 (对照的3株，将同样大小的空白PDA贴于伤口)，用棉花保湿，置于28℃环境条件下培养。

1.2.3 接种后酶活性测定

分别于接种后连续5d，每天测定叶片的SOD、PPO、CAT活性。叶片取样同1.2.1。

1.2.4 酶活性测定方法

SOD活性测定采用氮蓝四唑法［9］，以每分钟抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位;CAT活性测定采用比色法［10］，以每分钟D240值变化0.01为一个酶活性单位;PPO活性测定采用邻苯二酚法，反应体系为:2.9ml0.05mol/L磷酸缓冲液 (pH值7.8)、1ml0.1mol/L邻苯二酚，0.1ml酶液，加入酶液后于30℃保温10min，立即加入2ml 20%(W/V)的TCA(三氯乙酸)终止反应，测398nm OD值，以△OD398nm/g·Fw·min表示酶活性。

2 结果与分析

2.1 对照剑麻的酶活性变化

不接种烟草疫霉菌的剑麻，其SOD、CAT、PPO三种酶的活性，在接种前后的变化情况见表1。经方差分析，在接种培养基前后6d，三种酶的活性变化无显著差异。

表1 对照的剑麻酶活性的变化情况Tab.1 Change of the important defensive enzyme activities of the control group

2.2 处理剑麻的酶活性变化

接种烟草疫霉菌的剑麻，其SOD、CAT、PPO三种酶的活性，分别如图1、图2和图3所示。从图1可见:H.11648麻在接种烟草疫霉菌前后6d内，SOD活性变化不大，经显著性测验表明，6d间的SOD活性无显著差异。从图2可见:H.11648麻在接种烟草疫霉菌后，前2d内，CAT活性变化不大，但从第3d后明显上升，至第5d达到高峰，显著性测验也验证了该结论。从图3可见:H.11648麻在接种烟草疫霉菌后，PPO活性，第1d显著下降，第2d又显著上升，第3d没多大变化，第4d又显著下降到最低点，但第5d又上升到最高点。表2对接种前后SOD、CAT、PPO活性的变化进行了显著性测定。

图1 H.11648麻接种烟草疫霉菌后SOD活性变化Fig.1 Change of SOD contents of Agave hybrid No.11648 inoculated with P.nicotianae

图2 H.11648麻接种烟草疫霉菌后CAT活性变化Fig.2 Change of CAT contents of Agave hybrid No.11648 inoculated with P.nicotianae

图3 H.11648麻接种烟草疫霉菌后PPO活性变化Fig.3 Change of PPO contents of Agave hybrid No.11648 inoculated with P.nicotianae

表2 接种前后SOD、CAT、PPO酶活性变化情况Tab.2 Change of the important defensive enzyme activities of Agave hybrid No.11648 before and after inoculation

3 结论与讨论

3.1 剑麻在用针刺伤后，贴上PDA培养基，其SOD、CAT、PPO的活性，前后6d都没有明显变化，说明针刺对剑麻表皮造成的微小伤口，不足以对剑麻内部的生理生化等新陈代谢产生影响，因此，对叶片中的酶活性也较少影响。

3.2 接种烟草疫霉菌后，CAT活性前2d变化不大，但第3d显著上升，至第5d达到高峰。这是因为CAT是一种活性氧清除剂，当剑麻接种疫霉菌后，感病的剑麻组织会产生一系列的生理生化反应，O2－积累，加速染病细胞死亡，限制病菌进一步扩展，随后CAT上升，清除过多积累的O2－，避免造成膜脂过氧化伤害健康细胞，与刘琳［10］报道的结果相同。但SOD活性的变化规律与CAT活性的变化规律不同，它没有显著的变化，这与刘琳［10］、周小慧［11］、陈艺晖［12］等报道的结果不相符，但与苗则彥［13］报道的结果相同，需要留待以后继续验证。

3.3 多酚氧化酶 (PPO)是酚类物质氧化的关键酶，参与植物体内酚类物质氧化产生醌类和参与木质素的合成，以杀死和抑制病原菌的繁殖而起到抗病作用［14］。关于PPO与植物抗病性的关系，已见的报道各不相同［4，15，16］剑麻接种烟草疫霉菌后，PPO活性表现为先下降，后上升，再下降，又上升的特点，接种病原菌后1d，PPO活性受到一定的抑制，而后显著上升，可能因为接种成功后，植物组织发生了激烈的反应，因而PPO活性升高，以阻止病原菌的扩展，但因为H.11648是高感品种，其抵抗力有限，至第4d又出现活性下降，第5d又出现周期性的上升。

3.4 关于SOD等抗性酶系统与植物抗病性的关系，前人研究了很多，但得出的结论各有异同，本文仅以高感品种H.11648为试材，对接种病原菌后，几种防御酶的活性变化作了初步探讨，为研究酶活性与剑麻抗病性的关系奠定了一定基础。今后应以多种抗性剑麻品种为材料，对其相关性作更深一步的研究，为指导剑麻抗病育种作出贡献。

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