17-AAG对MCF-7细胞增殖的抑制作用及对STAT3和VEGF表达的影响

肖丽君，赵恩宏，赵爽，高艺铭，郭璐，许倩

（承德医学院1.免疫教研室；2.附属医院肿瘤外科；3.基础医学研究所，河北 承德06 7020）

乳腺癌的发病率和死亡率逐年升高，侵袭和转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）可与乳腺癌细胞中的多种信号分子和激酶结合形成复合物，参与调控乳腺癌的侵袭和转移［1］。17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素（17-allylamino-17-desmethoxy-geldanamycin，17-AAG）可强烈抑制HSP90，从而通过降解客户蛋白、诱导肿瘤凋亡、干扰细胞周期等抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。研究表明，17-AAG抗乳腺癌作用显著［2］。本研究拟观察17-AAG对乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用及对细胞信号转导和转录活化蛋白3（signal transducer and activator of transcriptions3，STAT3）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA 和蛋白表达的影响，旨在为17-AAG抗乳腺癌作用探寻新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及试剂：人乳腺癌MCF-7细胞株由承德医学院附属医院中心实验室馈赠。DMEM培养基（美国GIBCO BRL公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；MTT（美国Peprotech公司）；Trizol总RNA提取试剂（美国Invitrogen公司）；RT-PCR（AMV）试剂盒（日本TaKaRa公司）；引物及内参（上海生物工程技术有限公司）；溴化乙锭（美国GIBCO BRL公司）；STAT3单克隆抗体（美国Epitmics公司）；VEGF、β-actin单克隆抗体（美国 Santa Cruz公司）；辣根酶标记羊抗兔和羊抗鼠IgG（美国KPL公司）；ECL超敏发光液（北京普利莱基因技术有限公司）。

1.1.2 仪器：090-135.001倒置显微镜（德国Leica公司）；Sorvall/Biofuge fresco高速冷冻离心机、150培养箱（德国Heraeus公司）；MK3酶标仪（芬兰雷勃公司）；Icycler PCR仪（美国Bio-Rad公司）；96孔、6孔细胞培养板（美国Corning公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：用含10%胎牛血清的DMEM培养基（添加1 mmol/L丙酮酸钠，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U/L青霉素及链霉素）于37℃、5%CO2培养箱中培养MCF-7细胞，每3 d换液1次，并传代培养，培养细胞至对数生长期。

1.2.2 MTT法测定细胞增殖情况：取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液。计数，离心，调整细胞浓度为5×104/mL。加入96孔板（190μL/孔），37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。向实验组细胞加入17-AAG（终浓度：0.165、0.310、0.620、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/L），每个浓度设5 个复孔，同时设立对照组（不加药）和空白对照组（不加细胞及培养液）。培养24h及48h后，加入MTT（5g/L，10μL/孔）。培养4 h后，弃上层培养液，加入二甲基亚砜150 μL/孔，震荡10 min，待蓝色结晶完全溶解后，在酶标仪492、540、650 nm波长处检测各孔OD值。计算17-AAG对肿瘤细胞的生长抑制率=（1－OD实验组/OD对照组）×100%，做图获得剂量反应曲线，计算半数抑制浓度（IC50）。

1.2.3 RT-PCR检测17-AAG作用后人乳腺癌MCF-7细胞株STAT3、VEGFmRNA的表达：取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/mL，加入6孔板（3 mL/孔），37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，加入17-AAG（终浓度：1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L），每个浓度设5 个复孔，同时设立对照组（不加药组）。终止培养后，每孔加入500 μL Trizol提取液提取细胞总RNA，参照RTPCR试剂盒说明书进行操作，STAT3基因引物：上游：AGCGGGAAATCGTGCGTGAC，下游：ACATCTG CTGGAAGGTGGAC，扩增产物447 bp；VEGF基因引物：上游：ATCACGAAGTGGTGAAGTTC，下游：TGCTGTAGGAAGCTCATCTC，扩增产物265 bp；内参照β-actin基因引物：上游：AGCGGGAAATCGTG CGTGAC，下游：ACATCTGCTGGAAGGTGGAC，扩增产物453 bp。cDNA合成反应条件：30℃10 min，42℃30 min，99 ℃5 min，5 ℃5min；PCR 扩增反应条件：STAT3：94 ℃2min，94 ℃30 s，58 ℃30s，72 ℃ 45 s，28 个循环；VEGF：94 ℃2min，94 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃ 45 s，28 个循环；β-actin：94 ℃2min，94 ℃30s，58℃30 s，72℃1min，28个循环。取 PCR 产物行2%琼脂糖凝胶电泳（120 V，30 min），拍照观察。用Quantity One软件进行图像灰度分析。每组实验至少重复5次，计算目的基因与内参照β-actin灰度比值。

1.2.4 Western blot检测STAT3、VEGF蛋白的表达：取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为5×104/mL，加入6孔板（3 mL/孔），37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，加入17-AAG（终浓度：1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L），每个浓度设5 个复孔，同时设立对照组（不加药）。48 h后终止培养，PBS洗细胞2次，加入预冷的细胞裂解液，冰上裂解20 min，4℃、12000 r/min离心20 min，收集上清，蛋白定量。取50 μg蛋白行8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，含5%脱脂奶粉TBS-T溶液封闭，室温下与兔抗人STAT3、VEGF单克隆抗体（1︰300稀释）孵育，再与相应的HR-PO抗Ig抗体耦联物（1︰2000稀释）孵育，以上各步骤间用TBS-T洗膜。ECL显影，洗片。以β-actin（1︰100稀释）作内参照。用Quantity one分析软件测定图像条带灰度值，计算STAT3与VEGF的相对含量（STAT3、VEGF蛋白条带灰度值/内参照β-actin蛋白条带灰度值）。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 17-AAG对MCF-7细胞增殖的影响

MTT结果显示：0.165～10.000 mg/L17-AAG对乳腺癌MCF-7细胞有显著的抑制作用，且有明显的量效关系；体外作用48 h细胞增殖抑制率（IC50均值6.22）优于24 h（IC50均值34.61）。见表1，图1。

2.2 不同浓度17-AAG对MCF-7细胞STAT3、VEGFmRNA表达的影响

RT-PCR结果显示：17-AAG作用48 h后，实验组MCF-7细胞中STAT3、VEGFmRNA的表达水平降低，呈浓度依赖性。实验组与对照组、各实验组之间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2，图2。

2.3 不同浓度17-AAG对MCF-7细胞STAT3、VEGF蛋白表达的影响

Western blot 结果显 示：1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L17-AAG作用48 h后，各实验组细胞STAT3、VEGF蛋白的表达量逐渐降低，呈浓度依赖性。实验组与对照组、各实验组之间两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3，图3。

3 讨论

目前已证实STAT3在多种人类恶性肿瘤组织及细胞系中存在高表达［3，4］。研究表明，当 STAT3 发生持续性激活时，一系列与细胞增殖、分化、凋亡等密切相关的基因出现异常的高表达，细胞向恶性转化［5］。STAT3可能是1种癌基因，它参与的信号转导途径异常可能在肿瘤的侵袭、转移中起重要作用［6］。STAT3可通过调节多种激酶作用，破坏E-钙黏着蛋白/b-链蛋白复合物，使b-链蛋白的酪氨酸磷酸化后从细胞膜释放，使细胞间黏附能力下降，肿瘤细胞更易于脱离原发灶，从而促进肿瘤转移［7］。

肿瘤细胞侵袭转移到邻近组织及远处器官是1个多步骤的复杂的过程。肿瘤血管新生是肿瘤浸润转移必不可少的环节。VEGF是一种参与机体血管生成的细胞因子，也是迄今研究最多且最深入的肿瘤新生血管标志分子。它的启动子位于－38 bp到－2274 bp，具有低氧诱导因子1、激活蛋白、早期生长应答因子l及STAT-3等多个因子的结合位点。VEGF的表达受诸多因素的调控，最近的研究表明，STAT3能直接调控VEGF的转录［8］，持续激活STAT3能诱导VEGF的表达，导致肿瘤新生血管形成；用STAT3的显性负性突变体或反义寡核苷酸阻断STAT3信号通路能抑制由Src和IL-6介导的VEGF的表达上调，从而抑制肿瘤的生长与侵袭转移。阻断STAT3的激活能抑制内皮细胞的迁移及微血管的形成［6］。提示VEGF/STAT3信号通路的激活可能是促进肿瘤新生血管形成的关键因素之一。

17-AAG是HSP90的抑制剂，可通过与HSP90特异性结合降解其客户蛋白而发挥抗肿瘤作用。17-AAG的抗肿瘤（如乳腺癌、黑色素瘤等）研究已进入Ⅱ期临床试验［2，9］。17-AAG在抗侵袭和抗肿瘤血管新生方面的确切机制尚缺乏深入研究。Cheong等［10］报道，异泽兰黄素可以通过阻断胃癌MKN-45细胞的STAT3通路而抑制VEGF表达。本研究结果显示：1.0、2.0、3.0 及5.0 mg/L17-AAG 作用人乳腺癌MCF-7细胞株12、24、48 h后，细胞内 STAT3和VEGFmRNA及蛋白表达均下调，且具有时间和浓度依赖性，尤其对STAT3的下调作用显著。提示17-AAG可能通过阻断STAT3通路而下调VEGF的表达，进而产生抗肿瘤血管新生作用。未来我们将对STAT3通路的上游或下游是否还存在其他直接或间接调控VEGF表达的因子进行进一步深入的研究。

［1］Zagouri F，Sergentanis TN，Gazouli M，et al.HSP90，HSPA8，HIF-1 alpha and HSP70-2 polymorphisms in breast cancer：a case-control study［J］.Mol Biol Rep，2012，39（12）：10873-10879.

［2］Modi S，Stopeck A，Linden H，et al.HSP90 inhibition is effective in breast cancer：a phase II trial of tanespimycin （17-AAG） plus trastuzumab in patients with HER2-positive metastatic breast cancer progressing on trastuzumab ［J］.Clin Cancer Res，2011，17（15）：5132-5139.

［3］Lui VW，Wong EY，Ho Y，et al.STAT3 activation contributes directly to Epstein-Barr virus-mediated invasiveness of nasopharyngeal cancer cells in vitro［J］.Int J Cancer，2009，125（8）：1884-1893.

［4］ Kunigal S，Lakka SS，Sodadasu PK，et al.Star3-siRNA induces Fasmediated apoptosis in vitro and in vivo in breast cancer［J］.Int J Oncol，2009，34（5）：1209-1220.

［5］Sen B，Saigal B，Parikh N，et al.Sustained are inhibition results in signal transducer and activator of transcription3（STAT3）activation and cancer cell survival via altered Janus.activated kinase-STAT3 binding［J］.Cancer Res，2009，69（5）：1958-1965.

［6］Page BD，Ball DP，Gunning PT.Signal transducer and activator of transcription3 inhibitors：a patent review［J］.Expert Opin Ther Pat，2011，21（1）：65-83.

［7］ Rivat C，Rodrigues S，Bruyneel E，et al.Implication of STAT3 signaling in human colonic cancer cells during intestinal trefoil factor3 （TFF3）and vascular endothelial growth factor-mediated cellular invasion and tumor growth［J］.Cancer Res，2005，65（1）：195-202.

［8］CascioS，FerlaRD，AndreaA，etal.Expressionofangiogenic regulators，VEGF and leptin，is regulated by the EGF/PI3 K/STAT3 pathway in colorectal cancer cells［J］.J Cell Physiol，2009，221（1）：189-194.

［9］Pacey S，Gore M，Chao D，et al.A Phase II trial of17-allylamino，17-demethoxygeldanamycin （17-AAG，tanespimycin）in patients with metastatic melanoma［J］.Invest New Drugs，2012，30（1）：341-349.

［10］Cheong JH，Hong SY，Zheng Y，et al.Eupatilin inhibits gastric cancer cell growth by blocking STAT3-mediated VEGF expression［J］.J Gastric Cancer，2011，11（1）：16-22.