人源醛酮还原酶7A2融合蛋白的纯化及其对苯代谢产物的催化活性

李丹，初阳，刘雅茹，张歧山，秦勇

（1.中国医科大学药学院生物制药教研室，沈阳110001；2.中国医科大学附属第一医院药学部，沈阳110001；3.沈阳军区总医院医学情报科，沈阳1108 40）

苯是环境污染物中广泛存在的一种致癌物质，可引起非淋巴细胞性白血病等血液疾病，低剂量的苯还能引起白细胞及血小板减少［1］。苯的毒性大部分来源于它的代谢产物。苯代谢产物主要通过2种途径产生：一种是通过对苯环的修饰，如苯甲醛和对苯醌，一种是通过开环反应，如反向，反向-2，4-二烯-1，6-己二酮（trans，trans-muconaldehyde，MUC）［2］。这2种代谢途径都能产生具有毒性和致畸性的产物，能导致骨髓细胞形成微核，能与DNA、蛋白质直接反应形成复合物，导致细胞损害［3～5］。目前关于苯的代谢途径及调控回路尚未完全清楚［6］。结合多个苯代谢产物具有羟基的结构特征，本研究拟探索醛酮还原酶（aldo-keto reductase，AKR）在苯代谢途径中的潜在作用。AKR是一类针对羰基化合物的NADPH依赖型氧化还原酶，广泛存在于细菌、酵母、哺乳动物中［7］，能催化还原一系列自然界存在的或合成的醛酮化合物为毒性较小或无毒性的相应的醇［8］。人源AKR7A2最早在脑中发现，是琥珀半醛还原酶，能还原琥珀半醛为γ-羟基丁酸甲酯［9］。后期研究发现，AKR7A2还分布于肝和肾等多种组织［10］，而且对多种醛或酮有催化活性，对具有芳香环结构或双羟基结构的醛或酮也具有一定催化活性［10，11］。本研究拟使用快速蛋白液相层析（fast protein liquid chromatography，FPLC）系统采用两步纯化法纯化重组AKR7A2融合蛋白，并通过酶活性实验检测AKR7A2重组蛋白对苯代谢产物的底物特异性，为进一步探索苯及其代谢产物的代谢途径提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌BL21购自Novagen公司；ECL试剂盒购自PIERCE公司；蛋白分子量标准购自NEB公司；5 mL HiTrap亲和柱购自GE公司；NADPH、苯甲醛、对苯醌、MUC及IPTG购自Sigma公司；AKR7A2的重组质粒pLI19和兔抗AKR7A2多克隆抗体由英国University of Strathclyde的Elizabeth Ellis博士惠赠［9］；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的转化和诱导表达：将质粒pLI19转化至BL21细菌感受态，涂布于含氨苄霉素和氯霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取转化后单菌落接种到培养基中，37℃培养过夜后，将菌液按1︰50接种到500mL培养基中，培养至A600约为0.6时加入IPTG，37℃诱导培养约2 h。收集菌液，并取少量菌液加入1×SDS loading buffer中，100℃加热5 min，取上清进行100 g/L的SDS-PAGE电泳。聚丙烯凝胶考马斯亮蓝染色，脱色后观察诱导蛋白表达。

1.2.2 使用FPLC系统纯化AKR7A2融合蛋白：挑取转化后的菌落，经诱导培养后收集菌体，加入溶解缓冲液充分重悬菌体，超声破碎2 min，冰浴20 min；4℃，12000 r/min离心20 min后收集上清液。融合蛋白的纯化使用Pharmacia公司的FPLC系统。将上清液稀释到50 mL，加入HiTrap亲和柱中，用50 mL Start buffer清洗，经梯度洗脱后，收集洗脱液。将HiTrap柱的洗脱液加入到G25 Sephadex凝胶柱中，经Desalt buffer洗脱后，收集洗脱液。从2次洗脱液中分别取10 μL纯化的蛋白，加入2×SDS loading buffer，100℃加热5 min，行SDS-PAGE电泳。聚丙烯凝胶考马斯亮蓝染色，脱色后观察重组蛋白的纯化。

1.2.3 Western blot：将纯化后的蛋白经100 g/L的SDS-PAGE凝胶分离后转至PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉常温封闭1 h，TBST洗膜15 min×4次。加入兔抗 AKR7A2抗体（1︰2000），4℃过夜，TBST洗膜15 min×4 次。加 HRP-羊抗兔 IgG（1︰10000），室温1 h，TBST洗15 min×4次。ECL显色曝光。

1.2.4 AKR酶活性实验检测AKR7A2对苯代谢产物的底物特异性：使用Beckman公司的DU650分光光度计进行AKR7A2的底物催化活性测定。反应在25℃进行，测量反应混合液在340 nm的光吸收值，反应混合液1mL中含100mol/L磷酸钠溶液（pH6.8），0.05 mol/L NADPH，约10 μg纯化蛋白和反应底物。以无纯化蛋白的反应混合液做空白对照，结果表达为 nmol·min－1·mg－1。AKR7A2 的特异性底物琥珀半醛、邻羧基苯甲醛和9，10-菲醌做阳性对照。

2 结果

2.1 AKR7A2融合蛋白的诱导表达及纯化

将重组质粒pLI19转化至BL21表达菌中，经IPTG37℃诱导2 h，取少量菌液经SDS-PAGE分析，可见诱导表达的蛋白在36 kDa处呈现明显的条带（图1C）。诱导后的菌体经超声裂解，离心，收集上清液。使用FPLC系统通过HiTrap亲和柱（图1A）及G25 Sephadex凝胶柱（图1B） 对 His标签的AKR7A2融合蛋白进行纯化，SDS-PAGE分析纯化后的蛋白可见单一的条带（图1C），表明重组AKR7A2蛋白被成功诱导表达并纯化获得高纯度的单一蛋白。

2.2 融合蛋白的鉴定

Western blot分析纯化后的蛋白，结果显示：两步纯化后的AKR7A2融合蛋白能被兔抗AKR7A2多克隆抗体特异性识别（图2），表明AKR7A2融合蛋白被成功纯化。

2.3 AKR酶活性实验结果

结果显示：AKR7A2重组蛋白对苯甲醛的底物特异性为（62±5）nmol·min－1·mg－1，表现为中等亲和力；对MUC的底物特异性为（149±8）nmol·min－1·mg－1，表现为较高的亲和力；对对苯醌的亲和力较低，底物特异性为（26±3.2）nmol·min－1·mg－1（表1）。

3 讨论

目前研究发现人体表达的AKR共有13个，其中AKR7A亚族有2个人源成员AKR7A2和AKR7A3［7］。AKR7A2作为脑中琥珀半醛还原酶的功能已有较多研究，最新研究发现AKR7A2还能保护细胞免受多个有毒醛或酮的毒害，是体内重要的保护酶之一［11，12］。AKR7A2成员对具有芳香环结构或双羟基结构的醛或酮也具有一定催化活性［10］，表明其有可能参与具有此结构特点的苯代谢产物的代谢。

本研究在BL21大肠杆菌中诱导表达His标签的AKR7A2融合蛋白，对His-AKR7A2融合蛋白的纯化方法进行优化，采用FPLC系统经HiTrap亲和柱和G25 Sephadex凝胶柱体外纯化His-AKR7A2蛋白。通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot验证了纯化后的AKR7A2重组蛋白。AKR酶活性实验检测纯化的AKR7A2重组蛋白对苯代谢产物苯甲醛、MUC和对苯醌的底物特异性，结果显示：AKR7A2对苯甲醛有中等亲和力，对MUC有较高的亲和力，但对对苯醌的亲和力较低。本研究结果表明，AKR对苯代谢产物有一定的催化活性，很可能参与苯的中间代谢产物的代谢，为探索苯的体内代谢途径提供了新思路。

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