复方山菊对自发性高血压大鼠心脏的保护作用

郝 伟，杨解人，张俊秀，李文星，刘 艳

(皖南医学院 药理学教研室，安徽 芜湖 241002)

高血压在我国的发病率逐年上升，其发病率高、致死、致残率亦高，可累及多处靶器官。左心室肥厚是高血压最常见的器官损害之一，也是心血管疾病的独立危险因素。左心室肥厚包括可导致心室壁张力增加，各种心律失常、并易发生心肌梗死、脑卒中甚至猝死。因此，防止和逆转左心室肥厚是当前治疗高血压病的主要目标之一。

复方山菊是由野菊花、罗布麻叶、淫羊藿及钩藤组成的新型复方制剂(由芜湖市中医医院提供)。其中野菊花具有降压、保护心脏、抑制血小板聚集、抗炎抗氧化、抗免疫作用［1］。罗布麻叶能够降压、降脂，抗氧化、抗衰老，保肝、改善心脏功能［2］。淫羊藿具有降压、降低血小板和红细胞聚集反应、延长凝血酶原时间，降低全血粘度，抑制血栓形成，抗氧化、抗衰老作用［3］。钩藤具有降压、抗心律失常、抑制血小板聚集［4］等作用。临床上发现将上述4种中药组成复方制剂能很好的降低高血压病人的血压，我们在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)上也证明口服复方山菊能够明显的降低血压、血脂、全血粘度及血尿酸［5－6］，减轻 SHR肾小球损伤，减少其系膜区胶原纤维沉积［7］等作用。但是对SHR心脏是否有保护作用，为何有保护作用均未见报道，故本试验选用SHR连续灌药16周，观察复方山菊对心脏的保护作用及可能机制，为临床用药提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性16周龄SHR 35只，Wistar-Kyoto(WKY)大鼠7只，体质量(300±50)g，许可证号:SCXK(沪)2007-0005(上海斯莱克动物有限公司)。颗粒饲料(南京青龙山动物试验中心)。大鼠自然光照，自由进食饮水，室温(23±2)℃，相对湿度60% ～65%。

1.2 药物和试剂 复方山菊，每粒含药0.1 g，相当于1.5 g生药，批号090314(芜湖市中医院提供);卡托普利片批号09102411(常州制药厂有限公司);HE染色剂:苏木精，伊红;MASSON染液试剂盒(南京建成生物工程研究所);免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 分组及给药 复方山菊成人每日用量为0.4 g(4粒)，按60 kg计算，折算成大鼠等效量(按千克体质量剂量折算系数)为0.047 g/kg，以0.05 g/kg为等效量(低剂量组)，按倍递增为0.15 g/kg(中剂量组)，0.45 g/kg(高剂量组)，卡托普利(0.03 g/kg)阳性对照组，每组7只。另设WKY正常对照组(蒸馏水5 ml/kg)7只。按上述设定剂量，每日下午5时灌胃给药(容积为5 ml/kg)，每日1次，连续16周。

1.4 HE染色和MASSON染色 末次给药后，3%戊巴比妥钠(10 ml/kg)麻醉，取左心室心肌，滤纸拭干。10%甲醛固定、包埋、切片、HE染色，光镜观察心肌组织病理学改变。MASSON染色(具体步骤参照试剂盒说明书)心肌组织切片，光镜下观察心肌组织胶原纤维的表达。

1.5 免疫组化法表达心肌 TGF-β1、c-fos和 iNOS蛋白 心肌组织石蜡横断面切片，厚度约4 μm/片，常规脱蜡至水，染色程序严格按照试剂盒步骤进行，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片观察。实验步骤参照试剂盒说明书。

结果判定:TGF-β1、c-fos、iNOS 均定位于心肌细胞的胞浆内。阳性呈黄至棕黄色。所有染色切片在同一条件下采用Image-pro plus 6.0图像分析软件进行半定量分析，测定其平均积分光密度值(AIOD)，阳性表达水平用AIOD(±s)表示，AIOD越大，TGF-β1、c-fos、iNOS 表达水平愈高;反之则表达水平愈低。

2 结果

2.1 复方山菊对自发性高血压大鼠心肌组织形态学的影响 光镜下，WKY大鼠心肌细胞排列整齐，心肌纤维结构清晰，未见心肌纤维破坏，细胞质丰富且均匀，细胞核形态正常，细胞间隙正常。与WKY组比较，SHR组心肌细胞增生肥大且排列紊乱，细胞核增大深染，有的核周围可见空泡性病变，心肌细胞间隙增宽，组织中可见大量的炎性细胞浸润，说明SHR心肌细胞具有病理损伤，当给不同剂量的复方山菊后，心肌纤维排列较整齐，结构清晰，炎性细胞浸润减少，说明心肌细胞的病理损伤得到不同程度的改善。提示复方山菊具有保护心肌细胞损伤，改善心肌纤维重构的作用(图1)。

2.2 复方山菊对自发性高血压大鼠心肌胶原纤维的影响 MASSON染色显示，心肌细胞为红色，胶原纤维为蓝色，WKY组心肌细胞间隙清晰可见，心肌间质旁胶原分布稀疏，着色较浅。与WKY组比较，SHR心肌间质和血管旁有明显蓝色深染，说明SHR心肌间质和血管旁纤维组织明显增多且排列紊乱，伴有严重的胶原沉积。与SHR组比较，随着复方山菊剂量的增加，心肌间质和血管旁的蓝色深染逐渐减少，胶原沉积现象逐渐减轻，说明复方山菊对SHR心肌间质胶原沉积有一定的改善作用(图2)。

2.3 复方山菊对自发性高血压大鼠心肌TGF-β1蛋白表达的影响 免疫组化图像分析显示，TGF-β1主要表达于心肌细胞胞浆内，呈棕黄色颗粒。与WKY比较SHR心肌TGF-β1蛋白显著增多，具有显著统计学差异(P＜0.01);与SHR比较，复方山菊0.45 g/kg、0.15 g/kg 剂量组和 Cap 组心肌 TGF-β1表达显著减少，具有显著统计学差异(P＜0.01)，说明复方山菊可下调SHR心肌TGF-β1蛋白的表达(图3)。

2.4 复方山菊对自发性高血压大鼠心肌c-fos蛋白表达的影响 免疫组化图像分析显示，c-fos主要表达于心肌细胞胞浆内，呈棕黄色颗粒。与WKY比较SHR心肌c-fos蛋白显著增多，具有显著统计学差异(P ＜0.01);与SHR 比较，复方山菊0.45 g/kg、0.15 g/kg剂量组和Cap组心肌c-fos表达显著减少，具有显著统计学差异(P＜0.01)，说明复方山菊可下调SHR心肌c-fos蛋白的表达(图4)。

图1 复方山菊对自发性高血压大鼠心肌组织形态学的影响(400×)Fig 1 Effect of compound shanju on myocardium in SHR by morphology results(HE×400)

图2 复方山菊对自发性高血压大鼠心肌胶原纤维的影响(400×)Fig 2 Effect of compound shanju on myocardial collagen fibres in SHR(400×)

图3 复方山菊对SHR心肌TGF-β1表达的影响(±s，n=7)Fig 3 Effect of compound shanju on the protein expression of TGF-β1 in myocardium of SHR

图4 复方山菊对SHR大鼠心肌c-fos表达的影响(±s，n=7)Fig 4 Effect of compound shanju on expression of protein c-fos in myocardium of SHR

2.5 复方山菊对自发性高血压大鼠心肌iNOS蛋白表达的影响 免疫组化图像分析显示，iNOS主要表达于心肌细胞胞浆内，呈棕黄色颗粒。与WKY比较SHR心肌iNOS蛋白显著增多，具有显著统计学差异(P＜0.01);与SHR比较，复方山菊0.45 g/kg、0.15 g/kg剂量组和Cap组心肌iNOS表达显著减少，具有显著统计学差异(P＜0.01)，说明复方山菊可下调SHR心肌iNOS蛋白的表达(图5)。

图5 复方山菊对SHR大鼠心肌iNOS表达的影响(±s，n=7)Fig 5 Effect of compound shanju on expression of protein iNOS in myocardium of SHR

3 讨论

本实验研究结果显示，SHR心肌细胞增生肥大且排列紊乱，细胞核增大深染，有的核周围可见空泡性病变，心肌细胞间隙增宽，组织中可见大量的炎性细胞浸润，心肌间质和血管旁纤维组织明显增多且排列紊乱，伴有严重的胶原沉积，说明SHR心肌细胞具有病理损伤。经复方山菊16周治疗后，SHR心肌纤维排列较整齐，结构清晰，炎性细胞浸润减少，心肌间质和血管旁的蓝色深染逐渐减少，胶原沉积现象逐渐减轻，表明复方山菊对SHR心肌损伤具有改善作用。

那么复方山菊是通过何种机制来保护心脏的?文献报道，高血压时RAAS系统被激活，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)增多，AngⅡ可直接引起心肌间质成纤维细胞的增殖，细胞外基质(ECM)组成成分如粘连素、层粘蛋白、Ⅰ型、Ⅲ型胶原等的合成增多［8］，并抑制ECM降解酶和基质金属蛋白酶(MMP)，抑制ECM的降解。此外，AngⅡ还可以刺激心肌成纤维细胞产生转化生长因子(TGF-β1)，TGF-β1可刺激其细胞外基质蛋白的合成［9］，抑制胶原降解，促进心肌肥大、心肌细胞表型改变。本次实验结果显示复方山菊高、中剂量组的心肌TGF-β1蛋白比SHR组显著下降，说明复方山菊可以通过下调心肌TGF-β1蛋白的表达，从而减少心肌胶原沉积，改善心肌的纤维化。

AngⅡ还可通过兴奋AT1受体激活c-fos而引起细胞功能活动［10］。c-fos属即早基因，可编码多种核内多种信息因子，对细胞分化、增殖起重要作用［11］。实验证明高血压左心室肥厚的形成和发展与心肌组织内原癌基因c-fos密切相关［12］。因此，很多学者将c-fos视为AngⅡ心肌肥厚的标志物［13］。进一步研究显示复方山菊高、中剂量组的心肌c-fos蛋白比SHR组显著下降，说明复方山菊可以通过下调心肌c-fos蛋白的表达，防止心肌细胞肥大，左心室肥厚。

此外，高血压时不仅RAAS系统被激活而导致了AngⅡ的增加，同时iNOS和ROS的产生也增多。iNOS可以进一步增加AngⅡ，而ROS则可以激活NF-κB，活化的NF-κB一方面可以增强心肌细胞的反应，另一方面通过促使iNOS的生成，更进一步地增加AngⅡ的含量，而大量的AngⅡ刺激心肌成纤维细胞产生过多的TGF-β1，促进心肌细胞原癌基因c-fos的表达增加，二者均可以引起心肌细胞增殖肥大，促使重构。iNOS的生物活性不依赖Ca2+钙调蛋白，当心肌肥厚时，在许多炎性因子的刺激下，心肌细胞可发生iNOS高度表达，后者可诱导产生大量的NO［14］，NO通过诱导心肌凋亡及使心肌细胞外基质金属蛋白水解酶活性增加，促进心肌重构，加重心功能损伤［15］。本实验研究结果显示SHR经复方山菊治疗16周后，心肌iNOS蛋白表达明显低于SHR组，说明复方山菊可通过下调SHR心肌iNOS蛋白的表达，抑制心肌细胞的凋亡从而促进细胞外基质的降解。

综上所述，复方山菊具有减少心肌胶原沉积，减轻心肌细胞病理损伤，逆转左心室肥厚，保护心脏的作用。其机制可能与下调心肌TGF-β1、c-fos及iNOS蛋白表达有关。

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