灌注华蟾素对SD大鼠膀胱肿瘤抑制的实验观察

潘彩明，沈群山，黄后宝，蔡张愉，王 啸，姜书传，董昌斌

(皖南医学院附属弋矶山医院 泌尿外科，安徽 芜湖 241001)

关于抗癌药物抑制膀胱肿瘤的动物研究，目前多以建立某品系大鼠的膀胱肿瘤模型，再运用药物进行灌注，以观察抗癌药的抑癌效果，其中动物模型的建立以MNU诱导大鼠膀胱肿瘤的模型较为稳定。华蟾素系中药大蟾蜍皮的水制剂，有研究表明运用华蟾素对大鼠膀胱肿瘤行灌注治疗，有一定的抗癌作用［1］，同时还能刺激骨髓增生，且华蟾素毒副作用较小，但与临床常用的膀胱灌注药物相比，其疗效如何，对肿瘤的发生、发展是否有一定的抑制作用，其相关研究较少，故本实验主要观察华蟾素灌注大鼠膀胱与常用预防膀胱癌的灌注药物如卡介苗、阿霉素相比疗效是否有差异;观察华蟾素膀胱灌注对SD大鼠的膀胱肿瘤的生长是否有干预影响。现将实验内容报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验动物 75只SD雌性大鼠，实验中大鼠周龄为3～15周，体质量150～350 g，由江苏南京青龙山动物实验中心提供，编号为［SCXK(苏)2007-0001］。

1.1.2 主要试剂 MNU购自美国Sigma公司，剂量为5mg/支(批号:20100525);BCG由上海生物制品研究所提供，剂量为 50mg/支(批号:200707001);ADM购自汕头经济特区明治原药有限公司，剂量为10mg/支(批号070901);华蟾素购于安徽金蟾生化股份有限公司。

1.2 方法 实验动物的饲养分组及灌注 实验动物饲养于SPF级实验室，随机分组，详见表1。

表1 动物分组及灌注剂量Tab 1 Animal grouping and the dosage of perfusion

1.3 药物灌注方法 向SD大鼠腹腔内注射戊巴比妥液，剂量按20 mg/kg换算。用碘伏液消毒其尿道外口，选用5 cm硬膜外导管经尿道插入膀胱，先排空尿液，再使用胰岛素注射器向每只大鼠膀胱内注入相对应药液0.2 ml。BCG液以20 ml生理盐水配制成 2.5 mg/ml，BCG 一次剂量 0.5 mg，约为3 mg/kg，与临床使用的较高浓度相当(按成人体质量50 kg计算，剂量为150 mg/次);华蟾素浓度为1 mg/ml，由前期预实验(序贯法)得出灌注0.2 mg，即每只用量0.2 ml;ADM每次灌注剂量是0.2 mg，与临床使用的浓度一致。

1.4 标本采集与组织病理学检查 所有实验大鼠均于灌注完成1周后处死，将膀胱完整切除，膀胱组织用10%甲醛液进行固定，行HE染色检查，观察SD大鼠的膀胱肿瘤的致瘤率及其病理分级，同时观察腹内脏器，并每组随机选取10只SD大鼠的其他脏器(卵巢、肝脏、脾、肾脏等)进行组织病理学检查。所有切片由两名病理科医师进行病理分级、分期检查(参考人类UICC、TNM系统标准)，分组信息未提供给病理科医师。

1.4 统计学方法 所有实验数据均重复3次。各组数值采用卡方检验进行分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 实验过程中A组大鼠毛色、生长、饮食、活动等情况均良好，B组大鼠一般情况较差，C、D、E组大鼠生长、饮食等情况较B组大鼠稍好，均未观察到明显血尿和便血，A组实验过程中死亡1只大鼠。

2.2 大体观察 A组膀胱体积较小，壁薄，多数膀胱壁黏膜光滑，血管清晰，无溃疡、充血、新生物等征象;少数膀胱壁黏膜充血，局部可见肿物，偶有结石样钙化，双侧肾脏及其他脏器未见粟粒样结节。B组膀胱体积较大，壁厚，黏膜表面绝大多数可见肿物，大小不等，有的肿物呈菜花状表现。C、D、E组膀胱壁表面可见多发的米粒状、乳头状或结节状肿物，体积较B组小。各组其他脏器和组织均未见肿瘤。

2.3 组织病理学检查 光镜观察A组大鼠14只大鼠均未见异常增生，绝大多数切片上皮细胞排列整齐;B组13只大鼠发生膀胱移行细胞癌，细胞层次增多，排列紊乱，有病理核分裂相，局部区域或多个区域乳头状增生(图1);C组6只大鼠发生膀胱移行细胞癌;D组7只大鼠发生膀胱移行细胞癌;E组5只大鼠发生膀胱移行细胞癌;C组、D组及E组三者病理类型相似(图2～4)。各组之间癌变率的比较见表2(χ2=20.060，P ＜0.05)。SD 大鼠的其他脏器(卵巢、肝脏、脾、肾脏等)组织病理学检查未见异常。

表2 各组大鼠膀胱肿瘤致瘤率的比较Tab 2 Comparison of the incidence rate of bladder cancer in rats in diffrent groups

图1 MNU组肿瘤组织病理图像(HE×100)Fig 1 Pathological image of tumor tissue for MNU group(HE×100)

图2 华蟾素组肿瘤组织病理图像(HE×100)Fig 2 Pathological image of tumor tissue for cinobufagin injection group(HE×100)

图3 ADM组肿瘤组织病理图像(HE×100)Fig 3 Pathological image of tumor tissue for ADM group(HE×100)

图4 BCG组肿瘤组织病理图像(HE×100)Fig 4 Pathological image of tumor tissue for BCG group(HE×100)

3 讨论

华蟾素是我国传统生物药材中华大蟾蜍皮经科学方法提取、加工制成的水溶性制剂，其主要有效成分为吲哚生物碱和蟾蜍毒素等。近年来，随着对华蟾素的药理作用和临床应用的深入研究，已证实了华蟾素具有抗病毒、抗肿瘤、止痛、强心、促进骨髓增生、增强机体免疫力等作用，尤其是具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化和促进细胞凋亡等作用［2－3］，使得华蟾素在抗肿瘤方面具有更广阔的应用前景。

现代实验研究已经证实Cino具有一定的抗肿瘤活性且相对毒性低，用药安全，能有效抑制DNA和 RNA 的合成，干扰细胞的代谢［4－5］。刘祥胜等［6］研究证实Cino能促进脾淋巴细胞分泌白细胞介素-2，增强了T淋巴细胞的免疫能力，从而提高其对肿瘤细胞的杀伤力。Cino还具有抑制肿瘤细胞增长和刺激免疫系统的作用［7］，显示Cino是理想的抗癌生物制剂。华蟾素虽有抗肿瘤活性，但由于具有相对的毒性，特别是心肌毒性［8］;在静脉使用时也有不良反应，其中以血管刺激导致疼痛和药物过敏反应较为多见;少数患者还会出现寒战、高热、粒细胞减少等［9］。另外，临床上使用华蟾素注射液的多为患有恶性肿瘤的老年患者，身体基础情况又较差，致使许多患者长期使用华蟾素注射液静脉内治疗难以耐受。

有研究提示，华蟾素局部运用于大鼠膀胱肿瘤的灌注治疗，有一定的抗癌作用。本实验在诱导SD大鼠膀胱肿瘤过程中，选用华蟾素和临床上常用的膀胱灌注药物阿霉素、卡介苗等药物，与诱导致癌物MNU交替行灌注治疗，灌注结束一周后处死大鼠，病理结果提示运用华蟾素灌注的大鼠，其肿瘤的发生率与阿霉素组、卡介苗组相似，且华蟾素组大鼠的毛色、生长、饮食、活动等一般情况均较阿霉素组、卡介苗组为佳。林宇等［10］试验表明:华蟾素大剂量静脉注射和腹腔注射试验(静脉给药和腹腔注射给药的最大耐受量分别大于或等于50.0 g/kg、62.5 g/kg)也提示华蟾素无明显的毒性反应;卡介苗及阿霉素的毒副作用相对较多，已经在临床上得到证实，与本实验得出的结果一致。因此提示:华蟾素能有效地拮抗或抑制MNU诱导膀胱肿瘤的发生和进展，其抑制效果与临床上常用的灌注药物阿霉素、卡介苗效果相类似，且未发现有大鼠不适表现，提示华蟾素运用于膀胱癌的预防灌注较阿霉素、卡介苗的前景更有优势。华蟾素的抗膀胱肿瘤的可能作用机制［11－12］如下:①抑制血管内皮细胞的生长，诱导肿瘤细胞分化凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖;②具有免疫调节的功能;③显著增强了大鼠单核吞噬细胞的吞噬功能及体液免疫功能，可有效增强继发性免疫功能低下小鼠的细胞免疫作用。但华蟾素抑制肿瘤生成的具体机制尚要进一步研究，对华蟾素能否在临床运用于膀胱肿瘤的灌注治疗也仍需要按临床试验路径进一步观察。

［1］李建昌，柳建军，凌生涛.华蟾素对SD大鼠膀胱肿瘤的抑制作用［J］.第三军医大学学报，2012，34(8):726 －728.

［2］梁平，蒙富斌，王洪乾.华蟾素配合放疗治疗鼻咽癌近期疗效观察［J］.中国癌症防治杂志，2009，1(2):148 －150.

［3］QI FANGHUA，LI ANYUAN，ZHAO LIN，et al.Cinobufacini，an aqueous extract from Bufo bufogargarizans Cantor，induces apoptosis through a mitochondria-mediated pathway in human hepatocellular carcinoma cells［J］.J Ethnopharmacol，2010，128(3):654 － 661.

［4］KERR JF，WYLLIE AH，CURRIE AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics［J］.Br J Cancer，1972，26(4):239 － 257.

［5］MIRKES PE.2001 Warkany lecture:to die or not to die，therole of apoptosis in normal and abnormal mammalian development［J］.Teratology，2002，65(5):228 －239.

［6］刘祥胜，刘开俊，杨业金.华蟾素对Hela细胞生长和小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2的影响［J］.免疫学杂志，2005，21(3):132－135.

［7］张静.华蟾素联合化疗治疗晚期恶性肿瘤疗效分析［J］.肿瘤，2000，20(5):381.

［8］齐刚，张莉，何文彤，等.Bufalin的急性毒性研究［J］.武警医院学报，2004，1(1):10 －11.

［9］李冶武，王黎玲.华蟾素注射液不良反应文献分析［J］.实用中西医结合临床，2010，10(4):93 －94.

［10］林宇，付鉴，陈晓伟，等.华蟾素对肺癌抗癌作用的影响［J］.广州中医药大学学报，2003，20(1):69 －70.

［11］王双双，李柏，翟笑枫，等.华蟾素注射液抗肿瘤应用及其机制研究进展［J］.山东中医药大学学报，2008，32(5):436 －438.

［12］程文宁，肖家全.华蟾素抗肿瘤作用及其机制研究进展［J］.医学综述，2009，15(8):1193 －1194.