补肾健脾方对去卵巢大鼠骨质疏松症细胞因子水平的影响

王明乐

(河南科技大学第一附属医院，洛阳 471003)

骨质疏松症(ostoeporosis，简称OP)是以骨量减少、骨组织微细结构退行性改变为特征，骨脆性增加，易发生骨折的一种全身代谢性骨病。目前对骨质疏松症的西药治疗主要有骨吸收抑制剂和骨形成促进剂，虽然治疗药物较多，但有确切疗效的很少见。本研究通过去卵巢大鼠骨质疏松模型，研究补肾健脾方对血清 IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1等细胞因子水平的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物与主要试剂

补肾健脾方由河南科技大学天然药物化学教研室提供，每1g含生药2g，用蒸馏水将药物配成每毫升含生药 0.5g混悬液，置4℃冰箱备用(批号20081102)，购自北京四环制药二厂，取一类药片5mg，充分研细，用时用蒸馏水稀释至所需浓度。大鼠给药量按文献方法折算［1］。大鼠血清IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1ELISA测定试剂盒购自上海名典生物工程公司，为美国R＆D分装试剂。

1.2 动物

60只雌性6月龄清洁级SD大鼠，体质量270±10g，由河南省实验动物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 动物饲养及手术操作 将60只大鼠进行1周适应性饲养，将大鼠随机分为假手术组(Sham)(n=15)和去卵巢组(OVX)(n=45)。

手术过程:先将大鼠采用30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，取俯卧位于手术面板上。剪去大鼠背部中下部分被毛，碘伏消毒，在无菌条件下在背部中央做约1cm纵行切口，向两侧分离皮肤，在左右两侧腹后壁肌肉层较薄弱处打开腹腔，视野中可见乳白色发亮的脂肪团，卵巢即包埋其中。用无齿镊夹住脂肪团轻轻提出切口外，分离脂肪团，可见粉红色卵巢，用小号止血钳在子宫末端与卵巢之间的最细处夹闭，手术缝合线接扎后，用眼科剪将卵巢全部切除，松开止血钳将子宫轻轻还入腹腔，分别缝合肌肉层和皮肤对皮后，酒精棉球清理手术切口。Sham组大鼠在将卵巢提出体外后，仅切除部分卵巢周围的脂肪组织，其他操作同OVX组。

按每笼5只分笼饲养。各组间大鼠体质量差异无统计学意义，每日观察活动、饮食等一般状况，每月称量体质量1次。采用颗粒饲料按照Sham组大鼠摄食量喂养，自由饮水，室温保持22℃，相对湿度60%，每日光照12h(8am～8pm)。

1.3.2 分组及给药 大鼠全部苏醒后，将OVX组大鼠随机分为3组，即阳性对照、补肾健脾方组和去卵巢模型组，每组15只。

术后1周开始给药，阳性对照组，口服灌胃给予尼尔雌醇，每2周1次，0.21mg/kg体质量，每次2ml;补肾健脾方组口服灌胃给予补肾健脾方，生药含量为0.5g/ml，每次2ml，每天1次;假手术组和去卵巢组给予同剂量的自来水。

1.3.3 检测指标及方法 实验过程中，所有大鼠自由饮水摄食，每月称量1次体质量，大鼠处死前称量体质量。大鼠处死后取出子宫，称量子宫质量，并记算子宫指数，子宫指数=子宫湿重(g)/体质量(kg)。实验结束前，禁食1d，自由饮水，将全部大鼠股动脉放血处死，将全血转移至标记的离心管中，4℃静置30min后，以2000g在4℃离心20min，分离血清用于血清细胞因子ELISA检测。

1.4 统计学方法

采用 SPSS13.0统计软件分析，实验结果以均数±标准差(±s)表示，各组间进行单因素方差分析(ANOVA)，各组间两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 补肾健脾方对去卵巢大鼠体质量及子宫重量的影响

表1显示，实验开始时各组动物体质量之间未见有差别。随着时间变化，各组大鼠体质量逐渐增加，均呈增长趋势，但其增长在各组间比较差异无统计学意义。与假手术组比较，去卵巢组大鼠的子宫重量及子宫系数均明显降低(P＜0.01)，经尼尔雌醇和补肾健脾方治疗后子宫重量及子宫系数显著增高(P＜0.01)。

表1 补肾健脾方对去卵巢大鼠体质量及子宫湿重的影响

2.2 补肾健脾方对去卵巢大鼠血清IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1 的影响

与假手术组比较，去卵巢组大鼠IL-6和TNF-a水平显著升高，IL-4和IGF-1水平显著降低(P＜0.01)，尼尔雌醇和补肾健脾方治疗后，能降低IL-6和TNF-a水平，提高IL-4和IGF-1水平，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 补肾健脾方对去卵巢大鼠血清IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1的影响

3 讨论

骨质疏松症是一种多病因的增龄性病变，随着老龄化社会的到来越来越受到人们的重视。目前认为本病主要与年龄、内分泌紊乱、钙吸收不良以、免疫、遗传、营养与生活方式等因素有关，主要临床表现为胸背部和下腰部疼痛、畸形及骨折。骨质疏松大鼠模型的制作方法主要有维甲酸、去卵巢和糖皮质激素造模3种，采用雌性大鼠双侧卵巢切除方法进行造模，是研究绝经后骨质疏松症(PMO)的经典模型［2］。现代医学研究认为，PMO是一种由于女性绝经后体内雌激素水平下降导致的骨质疏松症，因此雌激素替代疗法(ERT)是当前防治绝经后骨质疏松的首选方法，然而长期使用雌激素会增加乳腺癌、脑卒中、心肌梗死、胆囊炎以及血栓形成等发病风险。

中医学上把骨质疏松症归属为“虚劳”、“骨痹”、“骨痿”范畴。根据中医“肾主骨”理论，肾精不足、肾气虚衰是导致原发性骨质疏松的重要原因，用来治疗骨质疏松症的中医药组方多从补肾着手，补肾药物可通过补肾益脾达到补骨的作用。近年来，在临床和基础实验中证实很多富含植物雌激素的单味中药如淫羊藿、大豆、骨碎补等及其提取物、中药复方具有明显的抗骨质疏松作用［3～9］。

在骨代谢过程中，成骨细胞不断形成新骨，破骨细胞不断吸收旧骨，骨组织的形成和吸收达到一种动态的平衡，因此血清生化指标能反映骨组织的变化。TNF-a是由单核巨噬细胞产生的的一种细胞因子，主要作用于破骨细胞，使破骨细胞活性增强，是一种骨吸收促进剂，能抑制骨形成。IL-6是由激活的淋巴细胞、单核巨噬细胞、骨髓细胞合成和分泌，它是破骨细胞主要的调节因子之一，能够刺激破骨细胞的增殖和功能表达。IL-4也是影响破骨细胞的1个细胞因子，能与其他细胞因子、激素协同作用，共同调节破骨细胞形成及骨吸收。IL-4是一种骨吸收抑制剂，可以抑制破骨细胞及其前体。类胰岛素样生长因子(IGF)由成骨细胞合成，是骨骼中最丰富的生长因子。IGF-1可促进细胞增殖与分化，抑制凋亡，是促进骨形成的重要因素［10］。

本研究结果表明，去卵巢后大鼠体质量增加，子宫质量减轻，IL-6和TNF-a水平显著升高，IL-4和IGF-1水平显著降低，说明造模成功。用药组与模型组比较，均降低了IL-6和TNF-a水平，提高了IL-4和IGF-1水平，说明补肾健脾方极可能通过IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1等细胞因子起到治疗骨质疏松的作用。

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