盐酸恩诺沙星平衡水溶解度的测定

万 淼, 洪汉烈

(1. 中国地质大学 数学与物理学院，湖北 武汉 430074；2. 中国地质大学 地球科学学院，湖北 武汉 430074)

氟喹诺酮类抗生素自研制以来被不断用于人类和禽类疾病的治疗[1-2]，恩诺沙星作为第二代氟喹诺酮类药物是第一个动物专用的药物[3]。但是恩诺沙星为极微溶解的药物，所以不便使用；为了增加水溶性，可以利用恩诺沙星为两性化合物这一特点，使其与酸或者碱作用形成便于溶解的酸式盐或者碱式盐。盐酸恩诺沙星则为合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，又名乙基环丙沙星或恩氟沙星，为畜禽和水产专用氟喹诺酮类抗菌药物[4]。

抗生素经动物体后大部分以原药形式随排泄物排出体外，在废水[5]、矿物水[6]、未处理饮用水[7]、自来水[8]和地表水[9]等多处水体环境中都监测到残留药物，因此针对药物在水体环境中的行为、对生态环境的影响以及去除其残留的相关研究十分有必要。曾有研究表明，恩诺沙星的水溶解度仅为243.28 mg/L[10]，但是未见盐酸恩诺沙星水溶解度的研究。

检测抗生素的方法多为高效液相色谱法[10-13]、色谱-质谱联用[14]、化学发光法[4]及免疫分析法[15]等。但是这些方法有的需要预处理而耗时，有的所需仪器昂贵。而紫外分光光度计是常用的检测仪器，其基本工作原理是利用一定频率的紫外可见光照射被分析的物质，引起分子中价电子的跃迁，紫外可见光将有选择地被吸收。对于一个特定的波长，吸收的程度正比于试样中该成分的浓度，因此测量光谱可以进行定性分析，而且根据吸收与已知浓度的标样的比较，还能进行定量分析[16]。

本研究利用水平摇床法充分溶解盐酸恩诺沙星，采用紫外可见光分光光度计法测定其平衡水溶解度，并研究了pH对溶解度的影响，为该抗生素的生态风险评价及相关研究提供数据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

盐酸恩诺沙星(纯度为99.7%，购于武汉远程医药科技有限公司)盐酸、氢氧化钠颗粒、去离子水(15 MΩ·cm)。

调速多用振荡器(HY-4)、去离子水机(Aquelix 5)、0.22 μm滤膜、双光束紫外可见分光光度计(TU-1900)、X射线衍射仪 (XRD, Panalytical X'Pert PRO DY2198)、红外线光谱分析仪(FTIR, Nicolet 6700)。

1.2 试验方法

室温下称取0.400 g盐酸恩诺沙星溶于8 mL去离子水的离心管中得到过饱和溶液。将若干份相同的样品同时放在振荡器上进行水平振荡，每隔1 h取样两管作为平行样，先在4 500 r/min下离心5 min，取上清液过0.22 μm的滤膜，适当稀释后取样4 mL于双光束紫外可见分光光度计进行检测分析，从而确定盐酸恩诺沙星的水溶解度。

为了考察pH对溶解度的影响，进行以下试验。用天平分别称取0.400 g盐酸恩诺沙星溶于8 mL去离子水的离心管中得到过饱和溶液，此时溶液pH为5.3。向离心管中分别加入适量的1 mol/L盐酸或氢氧化钠溶液，调节过饱和溶液的初始pH分别至2.8、4.0、7.0、8.2和9.9；每种pH的样品同时准备若干份，使用振荡器进行充分溶解。每过一个小时取样两管，先在4 500 r/min下离心5 min，取上清液测量pH，并使其经过0.22 μm的滤膜过滤，适当稀释后取样4 mL于双光束紫外可见分光光度计中进行检测。

1.3 测定方法

X射线衍射仪(Cu Kα，40 kV，40 mA)检测盐酸恩诺沙星粉末的结晶质量。红外线光谱分析仪(KBr压片法，分辨率4 cm-1)检测盐酸恩诺沙星粉末的主要基团成分。采用紫外可见光分光光度计检测溶液中的盐酸恩诺沙星的浓度，根据扫描得到的光谱曲线说明276 nm为最大吸收波长。在该波长下利用浓度和吸收强度的关系做盐酸恩诺沙星水溶液的浓度标准曲线，其相关度为0.999。上述各种饱和溶液的浓度将依据标准曲线和检测的吸光度经过计算得到，从而可得到盐酸恩诺沙星的水溶解度。

2 结果与分析

2.1 盐酸恩诺沙星XRD和FTIR结果

图1(a)为盐酸恩诺沙星的结构式，左上角的哌嗪基团和右下角的羧基是其活性基团，从而使其在不同的pH下呈现不同的离子状态。图1(b)为盐酸恩诺沙星粉末的XRD图谱，可以看出其结晶度很好，纯度很高。表1列出了红外图谱的峰值及来源，其中1 732 cm-1的峰来自羧基中 C=O 的伸缩振动[17-18]，1 391 cm-1的峰来源于哌嗪基团中胺基的质子化[19]。

图1 盐酸恩诺沙星的结构式(a)与XRD(b)图谱Fig.1 Molecular structure (a) and X-ray diffraction (b) patterns of crystalline enrofloxacin hydrochloride

表1 盐酸恩诺沙星的红外图谱中的振动频率Table 1 Vibrational frequencies (cm-1) and assignments of enrofloxacin hydrochloride

2.2 水溶解度的测定及pH对水溶解度的影响

由图2(a)可以看出，盐酸恩诺沙星在溶解2 h后其溶解度达到最大值22.739 g/L，之后的1 h溶解度相对减小，溶解度在3 h后趋于平稳，第8h的溶解度为19.770 g/L，该值于前1 h的溶解度仅相差2.59%。图2(b)为不同时刻通过紫外分光光度计得到的吸收光谱。结果显示不同时刻吸收峰的位置基本不变；虽然峰的强度和宽度稍有改变，但峰形基本不变。这表明盐酸恩诺沙星样品溶液能在8 h内保持稳定。

图2 不同时间盐酸恩诺沙星的溶解度(a)及盐酸恩诺沙星溶液的吸收光谱(b)Fig.2 (a) Solubility and (b) adsorptive spectra of enrofloxacin hydrochloride at different time

为了考察pH对盐酸恩诺沙星水溶解度的影响，用1 M的HCl和NaOH调整溶液pH。从图3可看出，在第2至3 h的时候溶解度会出现明显的减小或增大；随着平衡时间的延长，溶解度逐渐趋于稳定。当pH分别为2.8、4.0、5.3、7.0、8.2和9.9时，溶解度分别为1.161 g/L、10.637 g/L、19.770 g/L、4.198 g/L、1.874 g/L和16.108 g/L(最后两次相邻时间点的浓度差均在3%以内)。盐酸恩诺沙星水溶液的pH为5.3，从试验可以看出此时的溶解度是最大的。

图3 不同pH条件下不同时刻盐酸恩诺沙星的溶解度Fig.3 Solubility of enrofloxacin hydrochloride at different time at pH value

不同pH下的盐酸恩诺沙星水溶液中，恩诺沙星将呈现不同的化学形式。恩诺沙星的离解常数pKa1和pKa2为6.1 和7.7[21]，据此可得图4所示的不同形式的恩诺沙星分配图。当pH低于pKa1时，恩诺沙星中哌嗪基的质子化导致恩诺沙星几乎完全以阳离子形式(EN+)存在；当pH高于pKa2时，羧基的去质子化使得恩诺沙星呈阴离子形式(EN-)；当pH介于pKa1和pKa2之间时，恩诺沙星两性离子(EN±)形式。本试验中，盐酸恩诺沙星溶解度最大时的pH为5.3，此时恩诺沙星绝大部分以阳离子(EN+)形式存在，小部分以两性离子(EN±)形式存在。溶解度次最大时的pH为9.9，此时的恩诺沙星几乎完全以阴离子 (EN-)形式存在于溶液中。

图4 不同pH下恩诺沙星的离子形式Fig.4 Speciation of enrofloxacin under different pH conditions

3 小 结

本研究利用水平摇床溶解盐酸恩诺沙星，依据被测物质在特定波长处的吸收程度与物质质量浓度呈正比的关系，应用紫外分光光度计在276 nm的检测波长下测定盐酸恩诺沙星的平衡水溶解度，并考察了pH对溶解度的影响。盐酸恩诺沙星饱和水溶液的pH为5.3，室温下溶解度为19.770 g/L。调整溶液pH值分别为2.8、4.0、7.0、8.2和9.9时，室温下溶解度分别为1.161 g/L、10.637 g/L、4.198 g/L、1.874 g/L和16.108 g/L。盐酸恩诺沙星平衡水溶解度最大时pH为5.3，此时绝大部分恩诺沙星以阳离子(EN+)形式存在，小部分以两性离子(EN±)形式存在。溶解度次最大时的pH为9.9，此时溶液中的恩诺沙星几乎完全以阴离子 (EN-)形式存在于溶液中。

参考文献：

[1] Witte W. Medical consequences of antibiotic use in agriculture[J]. Science, 1998, 279(5353): 996-997.

[2] Wispelwey B, Schafer K R. Fluoroquinolones in the management of community-acquired pneumonia in primary care [J]. Expert Review of Antiinfective Therapy, 2010, 8(11): 1 259-1 271.

[3] Martinez M, McDermott P, Walker R. Pharmacology of the fluoroquinolones: a perspective for the use in domestic animals [J]. The Veterinary Journal, 2006, 172(1): 10-28.

[4] 于 斐, 王瑞萍, 吴拥军, 等. 增强化学发光法测定盐酸恩诺沙星的含量[J]. 华西药学杂志, 2010, 25(6): 754-755.

[5] Seifrtová M, Pena A, Lino C M, et al. Determination of fluoroquinolone antibiotics in hospital and municipal wastewaters in Coimbra by liquid chromatography with a monolithic column and fluorescence detection [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, 391：799-805.

[6] Herrera-Herrera A V, Hernández-Borges J, Rodríguez-Delgado M. Ionic liquids as mobile phase additives for the high-performance liquid chromatographic analysis of fluoroquinolone antibiotics in water samples [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, 392: 1 439-1 446.

[7] Focazio M J, Kolpin D W, Barnes K K, et al. A national reconnaissance for pharmaceuticals and other organic wastewater contaminants in the United States-II) Untreated drinking water sources [J]. Science of the Total Environment, 2008, 402(2-3): 201-216.

[8] Yiruhan, Wang Q J, Mo C H, et al. Determination of four fluoroquinolone antibiotics in tap water in Guangzhou and Macao [J]. Environmental Pollution, 2010, 158(7): 2 350-2 358.

[9] Tong C, Zhou X, Guo Y. Occurrence and risk assessment of four typical fluoroquinolone antibiotics in raw and treated sewage and in receiving waters in Hangzhou, China [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(13): 7 303-7 309.

[10] 吴银宝，汪植三，廖新俤，等. 恩诺沙星水溶解度及正辛醇与水分配系数的测定[J]. 家畜生态学报, 2005, 26(5)：76-79.

[11] 庄春梅，钱毅玲. 高效液相色谱法评定动物性食品中恩诺沙星的不确定度[J]. 安全检测, 2011(12): 76-78.

[12] 贾 涛. UPLC检测饲料中恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星[J].饲料研究, 2012(10): 71-74.

[13] 刘荟岭, 刘中成, 于文会, 等. HPLC法测定鸡血清与鸡肉中恩诺沙星含量的对比试验[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2013(5): 66-68.

[14] 刘芃岩, 姜 宁, 王英峰, 等. 高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定鸡肉中残留的磺胺类和氟喹诺酮类兽药[J]. 色谱, 2008, 26(3): 348-352.

[15] 杨正涛, 张乃生, 魏 东. 氟喹诺酮类药物多组份残留的酶免疫分析法[J] . 中国兽医学报, 2008, 28(9): 1 057-1 060.

[16] 谭胜国，吴镇金，印怀文，等. 紫外可见分光度法测定恩诺沙星原料中恩诺沙星的含量[J]. 广东畜牧兽医科技, 2008, 33(5): 23-24.

[17] Trivedi P, Vasudevan D. Spectroscopic investigation of ciprofloxacin speciation at the goethite-water interface [J]. Environmental Science & Technology, 2007, 41(9), 3 153-3 158.

[18] Martinez Y N, Piel L, Castro G R, et al. Polyvinyl alcohol-pectin cryogel films for controlled release of enrofloxacin [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 167: 1 421-1 429.

[19] Goyner K W, Chorover J, Kubicki J D, et al. Sorption of the antibiotic ofloxacin to mesoporous and nonporous alumina and Silica [J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2005, 283(1): 160-170.

[20] Yan W, Zhang J, Jing C. Adsorption of enrofloxacin on montmorillonite: two-dimensional correlation ATR/FTIR spectroscopy study [J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2013, 390(1): 196-203.

[21] Barbosa J, Barrón D, Jiménez-Lozano E, et al. Comparison between capillary electrophoresis, liquid chromatography, petentiometric, and spectrophotometric techniques for evaluation of pKa values of zwitterionic drugs in acetonitrile-water mixtures[J]. Analytica Chimica Acta, 2001 437(27): 309-321.