MLST分型技术在链球菌属中的相关参数

张 颖，王卓林，张志美，王艳萍，徐倩倩，郭时金，沈志强

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.山东绿都安特动物药业有限公司，山东 滨州 256600；3.哈尔滨北方森林动物园，黑龙江 哈尔滨150322)

多位点序列分型(Multi-locus sequence typing, MLST)是在基因水平上通过测定多个管家基因的核苷酸序列来发现细菌变异的分型方法。多序列位点分型技术首先于1998年由Maiden等[1]应用于革兰氏阴性病原菌的研究，后来逐渐在许多病源微生物、环境细菌和真核生物中得到应用。MLST技术是由多位点酶电泳(multilocus enzyme electro-phoresis, MLEE)技术发展而来，MLEE技术于1966年被首先应用，之后被广泛用于病原微生物的流行病学研究中，但是由于MLEE方法是基于蛋白质水平上的研究，无法检测出某些核酸水平的变化。MLEE技术属于表型分型技术，是通过生物个体间多位点酶的差异来反映其遗传上的差异；而MLST技术不是分析基因的表达产物，而是分析基因的核苷酸序列。一个基因突变后形成不同的核苷酸序列，突变的核苷酸序列被定义为这个基因的等位基因[2]。此方法具有很多明显的优势。首先，简单方便，可重复性强，只需通过国际互联网就能对某一具体致病菌株在全球范围内的传播分布情况进行追踪监控；其次，由于细菌易出现自发性突变和与外源性基因的重组整合，克隆常呈现多样性特征。因此，荚膜多糖分群的传统血清学分型方法不能准确反映菌株的谱系关系，已无法满足细菌的分子流行病学研究，只仅仅适用于细菌性疾病暴发时的鉴别诊断。MLST技术则可以分析菌株的谱系关系，发现那些用常规的表型方法不能分型的菌株以及新出现变异的菌株。

MLST技术对多个管家基因核苷酸序列进行直接测序，所选择的位点序列通常位于管家基因内部，从而能够鉴定其位点上的遗传变异情况。选择的管家基因是那些通常肯定存在，并有足够的变异度来适应在这些位点产生变异的等位基因[3]。管家基因几乎都有保守性，但不同种属或同一种不同的菌株之间又有差异即变异性。通过核酸序列的测序可直接反映出管家基因的变异情况。一般都选7个管家基因的DNA序列(450～500 bp)，选取分散于基因组内部的多个位点会很大程度地提高区分能力，并且能够建立起那些彼此相关的菌株之间的进化轨迹。MLST方法是针对管家基因内部序列设计引物，然后进行PCR扩增反应和对PCR产物进行序列测定，每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱，即这株菌的序列型 ST(sequence type)。这样得到的每个ST均代表一组单独的核酸序列信息，然后再进行等位基因图谱(allelic profile)或序列类型(sequence types, STs)的鉴定，根据得到的等位基因图谱使用配对差异矩阵(matrix pair-wise differences)等方法构建系统发生树图进行聚类分析[4]。需要注意的是，一般7个管家基因的内部序列才能够得到一个菌株的等位基因图谱，且序列一定要与定义的等位基因相一致。序列必须呈线性，而且必须准确，否则即使一个信息错误，都会使菌株从一个已知的突变为一个未知的等位基因。

1 MLST技术在无乳链球菌中的相关参数

无乳链球菌(S.agalactiae)又叫B群链球菌，是一种人畜共患菌。无乳链球菌是一种常见病原菌，能引起动物和人感染，能够引起羊和奶牛的急、慢性乳房炎，人类败血症、脑膜炎、肺炎、化脓性关节炎、子宫内膜炎、泌尿道感染等，也是引起奶牛隐性乳房炎的重要致病菌之一。感染无乳链球菌的奶牛所产的乳汁中的乳糖及蛋白质等营养成份含量会下降，能直接影响乳品的质量，降低奶牛的产奶量；患隐性乳房炎的奶牛乳汁中的无乳链球菌及其产生的毒素能直接影响乳品质量，食用这样的乳制品后可引起人呕吐、腹泻、发烧、脱水等，严重危害食用者健康和公共卫生安全。我国食品法明确规定，应用抗生素治疗隐性乳房炎后的72～96 h之内的乳品不能食用；如长期应用抗生素无乳链球菌会产生耐药性，耐药菌会随着食物链进行传播扩散，导致消费者产生对某种抗生素药物的耐药性，给人类的健康和生命安全造成严重的威胁[5]。

MLST技术在无乳链球菌中选用以下7个管家基因：(1)乙醛还原酶，(2)苯丙氨酰基tRNA合成酶，(3)谷氨酰胺运载蛋白，(4)谷氨酰胺合成酶，(5)丝氨酸脱水酶，(6)葡萄糖激酶，(7)酮糖移转酶基因。所用的引物序列和扩增长度如表1所示。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，33个循环，72 ℃延伸10 min。

表1 无乳链球菌管家基因位点的相关试验参数Table 1 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of S.agalactiae

2 MLST分型技术在停乳链球菌似马亚种中的相关参数

停乳链球菌似马亚种(Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis, SDSE)是一种新出现的全球病菌，属于C群链球菌，一般可感染兽类，致动物出现脓肿、心内膜炎及乳腺炎，以前感染人的情况少见，最近几年才出现感染人的病例报导[6]。此病曾在我国“非典”时期发生[7]。

MLST技术在停乳链球菌似马亚种中选用以下7个管家基因，分别是葡萄糖激酶、谷氨酰胺转运蛋白、谷氨酸消旋酶、DNA错配修复蛋白、酮糖移转酶、黄嘌呤磷酸核糖转移酶和乙酰乙酰辅酶A硫解酶。所用的引物序列和扩增长度如表2所示。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性 45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，34个循环，72 ℃延伸10 min。

3 MLST分型技术在肺炎链球菌中的相关参数

肺炎链球菌(S.pneumoniae)为人兽共患菌，主要侵害刚断奶仔猪，近年来曾多次发生，无季节性。发病率时高时低，与天气变化有一定联系；不及时治疗一般会死亡，但肥育猪发病率和病死率都较低。用恩诺沙星等药物治疗有一定效果，用青霉素治疗效果不好[8]。本菌为条件致病菌，约有20%～40%正常的人群和动物的上呼吸道中存在此菌，当机体抵抗力下降时可发生内源性感染，同时也可发生外源性感染；可导致人的大叶性肺炎、化脓性胸膜炎、脑膜炎、败血症等，因此在本病防治工作中应注意人体保护[9]。

表2 停乳链球菌管家基因位点的相关试验参数Table 2 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of SDSE

肺炎链球菌的MLST数据库现在包含5000株左右的菌株，MLST技术在此病中有7个管家基因，分别为莽草素脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、葡萄糖激酶、酮糖移转酶、信号肽酶、黄嘌呤磷酸核糖转移酶及D-丙氨酸连接酶。所用的引物序列和扩增产物大小如表3所示。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。

表3 肺炎链球菌管家基因位点的相关试验参数Table 3 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of S. pneumoniae

4 MLST分型在化脓性链球菌中的相关参数

化脓性链球菌(也称为A组链球菌属，GAS)是链球菌属中最重要的致病菌，是儿童和成人呼吸道感染的重要病原菌，是具有高度流行性的细菌性病原体，全世界都有分布，据目前所知，人类是其唯一的生物学宿主，多数时候，GAS易感染外表组织，包括上呼吸道的粘膜上皮组织或皮肤的表皮层，分别导致咽炎或脓疱病[10]。在临床上常引起急性咽炎、丹毒、脓包病、猩红热、医源性伤口感染和产后感染等，此外化脓性链球菌感染还可发生急、慢性风湿热和急性肾小球肾炎等严重变态反应性并发症[11]。

化脓性链球菌的MLST数据库现在包含超过1000种菌株信息，MLST技术在化脓性链球菌中选用7个管家基因分别是乙酰辅酶A乙酰转移酶、葡萄糖激酶、黄嘌呤磷酸核糖转移酶、酮糖移转酶、谷氨酸消旋酶、谷氨酰胺转移白和DNA错配修复蛋白。所用的引物序列和扩增长度如表4所示。PCR反应条件如下：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，32个循环，72 ℃延伸10 min。

表4 化脓链球菌管家基因位点的相关试验参数Table 4 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of GAS

5 MLST分型技术在猪链球菌中的相关参数

猪链球菌(S.suis)是革兰氏阳性菌，猪链球菌病是由致病性链球菌引起的一种人畜共患急性传染病，属国家规定的二类动物疫病。S.suis作为一个重要的人兽共患致病性病原菌感染宿主后，可导致宿主出现败血症、脑膜炎、肺炎、心内膜炎和关节炎等。至今为止，根据荚膜多糖抗原的不同，S.suis有35个血清型。所有的血清型都能引起宿主感染，但猪链球菌血清2型(SS2)是引起宿主感染的最常见血清型[12]。自1968年丹麦[13]第一次报道有SS2感染人事件到2008年12月份为止，世界上共有400多例人感染病例被报道。1990年，在我国广东省首次发现猪群中有类似SS2链球菌病的发生，但未见人与人之间的感染事件。1998～1999年，江苏省[14]和浙江省的部分地区，在病猪中分离出猪链球菌菌株，经鉴定为SS2链球菌。2005年6月下旬，四川省资阳、内江等地有近80例患者急性发病，并有12例重症患者死亡，经鉴定后确诊为为2型猪链球菌感染。2006年入夏以来，我国的浙江、江西、安徽、江苏、湖南等省的部分地区出现了以高热为主要特征的猪病疫情，并迅速蔓延[15]。经分离鉴定，有2型猪链球菌感染。

MLST猪链球菌数据库是由King等建立并发展充实的。意大利学者Princivalli等[16]对2003年至2007年间分离的菌株进行MLST研究时发现，ST1型菌株主导着这几年的流行。与欧洲报道的相比，我国的分离株则以ST7型为主，其次是ST1型。叶长芸等[17]对国内两次暴发(1998年江苏、2005年四川)的猪链球菌菌株进行研究时，发现114株分离菌株中有106株分离菌株属于ST7型。王洪敏等[12]研究发现，在5株广东省人源SS2中有3株属于ST7型，有2株属于ST1型。ST7型菌株能刺激机体T细胞大量增殖并能诱导致炎因子释放，并且这个能力比ST1型菌株强[18]。

MLST技术在猪链球菌中选用的7个管家基因分别为5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶、葡萄糖激酶、60 KDa大小的分子伴侣、抗过氧化物、同源重组基因、天冬氨酸激酶及DNA错配修复蛋白。所用的引物序列和扩增长度如表5所示。PCR反应条件如下：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。

表5 猪链球菌管家基因位点的相关试验参数Table 5 The relevant experimental parameters of the housekeeping gene locus of S. suis

6 展 望

这种基于核酸序列测定的方法可以准确地记录细菌基因水平上的变异，并且核酸序列可以通过互联网方便地传递，所以MLST被用于研究细菌的流行病学、群体生物学、致病性和进化关系。MLST作为一种直接在基因水平上对微生物进行分型的方法，既适用于分子流行病学研究，也适用于分子进化学研究。因此，MLST成为近年来发展迅速的微生物分型方法。

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