量子点免疫层析试条定量检测系统的设计

马义才， 侯 飞，王春英

(电子科技大学 生命科学与技术学院，成都 610054)

量子点免疫层析试条定量检测系统的设计

马义才*， 侯 飞，王春英

(电子科技大学 生命科学与技术学院，成都 610054)

一种量子点免疫层析试条定量检测系统，由量子点免疫层析试条、试条架、扫描系统、电荷耦合器(CCD)、信号放大器、模/数转换器(A/D)、微处理器(MCU)、输出显示装置、打印机、键盘和一张与试条配套的IC卡构成。微处理器读取IC卡参数后控制试条架运动以适合扫描系统的光纤探头对试条进行自动扫描，采集的特征波长反射荧光经CCD、信号放大器、模/数转换器传输给微处理器进行光信号识别和浓度计算，输出显示装置显示结果。该系统能快速准确实现样品多元指标定量检测，具有检测快速、灵敏度高、结果客观、使用灵活等特点，在生物医学样品检测方面具有广泛应用前景。

量子点；定量检测系统；免疫层析试条；电荷耦合器；设计

图1 基于CCD的量子点免疫层析试条定量检测系统结构框图

图2 量子点免疫层析试条结构

生物医学样品多元指标快速同步定量检测，一直是本领域亟需解决而未能解决的问题。近年发展的量子点(Quantum Dot，QD)纳米颗粒可免受溶剂干扰，荧光发射强而稳定，已成为生物分子标记的新热点[1-8]。本文介绍一种基于CCD的量子点免疫层析试条定量检测系统，该系统能快速准确实现样品多元指标定量检测。

1 系统设计

1.1系统结构组成

量子点免疫层析试条定量检测系统结构见图1，包括量子点免疫层析试条、试条架、扫描系统、电荷耦合器(CCD)、信号放大器、模/数转换器(A/D)、微处理器(MCU)、输出显示装置、打印机、键盘和一张与试条配套的IC卡。

1)试条及试条架。图2为本系统量子点免疫层析试条结构。试条顺次设有相互搭接粘贴的样品垫、玻璃纤维膜结合垫、具有检测带和质控带的硝酸纤维分析膜、强吸水垫、试条反应终点指示标签和试条辨识标签。玻璃纤维膜结合垫包被有量子点免疫结合物，试条的检测带包被有被检物特异抗体或抗原，质控带包被有二抗质控物。待测样品(如血清或尿液) 施加到试条一端的样品垫上后, 样品中待测物组分利用试条毛细管作用慢慢向试条后端渗移，若样品中有被检物抗原或抗体，它们便与试条玻璃纤维膜结合垫上的量子点免疫结合物结合后继续渗移至试条检测带，与检测带包被的相应抗体或抗原发生特异性结合而被截留富集在检测带上，富集的量子点的量与样品中待测物含量成正比，通过检测量子点反射荧光信号强度即可确定待测物质量浓度。游离量子点免疫结合物则越过检测带，与包被在质控带的二抗反应。质控带用于试条质量控制和监测试条反应成败。试条架用于放置施加有待测样品的量子点免疫层析试条。

2)扫描系统包括一激发光源。在该激发光源的输出光路上依次为入射光耦合器、入射光纤、光纤探头、出射光纤、出射光耦合器，直至CCD。激发光源为发光二极管LED或激光二极管。光纤探头合束共用，其中心为入射光纤，周缘为出射光纤。

3) CCD及信号放大器。CCD位于出射光耦合器像面上，其输出端经信号放大器与A/D相连。CCD收集试条检测带和质控带反射来的特征波长荧光信号，将其转换为电信号后由信号放大器放大。

4)A/D转换器的输入端与信号放大器的输出端相连，其输出端与MCU的输入端相连。

5)MCU 采集、存储A/D传输来的数字信号，并对数字信号进行数据处理。MCU配有输出显示装置、打印机、键盘和一张与试条相配套的IC卡，它们分别与MCU相连。MCU与试条架之间还有一个驱动控制电路，该电路能使定量检测系统通过MCU读取IC卡上的参数后发出指令从而自动控制试条架运动以适合扫描系统发出的光能对试条检测带和质控带进行自动扫描。

6)输出显示装置可以为上位机、字母数字LCD、LED或声音等。系统配合不同的输出显示装置，实现样品多指标定量或定性检测：当系统用于样品定量检测时，输出显示装置可采用上位机或字母数字LCD；当系统用于样品定性检测时，输出显示装置可采用LED或声音。

7)IC卡用于贮存被检物检测标准曲线、试条质控带光密度参考监控值及检测者的相关信息。IC卡与MCU之间采用USB串口通讯。样品检测时，IC卡能适时插拔。

样品检测时，加有待检样品的量子点免疫层析试条置于试条架的试条槽内。光源发出的光经入射光耦合器进入入射光纤，入射光纤分2束经光纤探头分别照射到试条检测带和质控带上以激发检测带和质控带上的量子点免疫复合物发出特征波长反射荧光，2束反射荧光分别经检测带和质控带相对应的出射光纤、出射光耦合器后被CCD接收，CCD将光信号转换为电信号并放大后传输给A/D转换器，A/D转换器将放大后的电信号转换为数字信号后传输给MCU进行存储和数据处理，获得各被检物检测带光密度值(OD检测带)和质控带光密度值(OD质控带)，进而计算得到OD检测带/OD质控带比值或OD检测带/(OD检测带+OD质控带)比值，并自动根据IC卡上存贮的相应被检物标准曲线分析计算出被检物浓度，之后将检测结果传输给输出显示装置，完成整个检测过程。

1.2 量子点免疫层析试条制作

1.2.1 试条组件制备

1)样品垫。纤维素膜切成一定规格膜块，将其放入样品垫处理液(pH=7.2，0.03 mol/L磷酸盐缓冲液+5%BSA+0.1%Tween 20)中浸泡，取出，烘干。

2)结合垫。玻璃纤维膜切成一定规格膜块，在该膜块上加上量子点与被检物特异抗体或抗原的结合物溶液(即量子点免疫结合物溶液)，烘干膜块。

3)分析膜。硝酸纤维素膜切成一定规格膜块，在该膜块上相隔一定距离分别喷点被检物特异抗体或抗原作为检测带和喷点二抗质控物作质控带，烘干膜块。

4)强吸水垫。纤维素膜切成一定规格膜块，干燥备用。

5)试条反应终点指示标签。选用变色范围为5.0～9.0的精密pH试纸，切成一定规格膜块，干燥备用。

6)试条辩识标签。选用印制有试条标识的标签纸并切成一定规格膜块，干燥备用。

1.2.2 试条装配

制备好的试条各组件按样品垫、玻璃纤维膜结合垫、分析膜、强吸水垫、试条反应终点指示标签、试条辩识标签顺次相互搭接粘于塑料衬垫上，剪切成一定规格试条。

1.3 被检物标准曲线制备与存贮

1.3.1 被检物标准曲线制备

1)配制被检物标准品系列质量浓度。2)将各标准品系列质量浓度置于本系统测得相应OD检测带和OD质控带并分别计算出OD检测带/OD质控带比值或OD检测带/(OD检测带+OD质控带)比值。3)以各标准品系列质量浓度作X轴，测试结果以OD检测带/OD质控带比值或OD检测带/(OD检测带+OD质控带)比值作Y轴，绘制标准曲线。

图3 乙肝表面抗原(HBsAg)标准曲线(示单项检测)

图4 血清肿瘤标志物AFP、CEA和PSA标准曲线(示一检多项)

图5 量子点标记的乙肝表面抗原(HBsAg)荧光光谱(示单项检测)

图6 量子点标记的血清肿瘤标志物AFP、CEA和PSA荧光光谱(示一检多项)

图3为乙肝表面抗原(HBsAg)标准曲线(示单项检测，其中：X轴为HBsAg标准品系列质量浓度；Y轴为HBsAg标准品系列)。制备方法：1)HBsAg标准品系列质量浓度配制。用1∶10稀释的正常人血清(以pH=7.2，0.03 mol/L PB缓冲液稀释)作稀释液，将HBsAg标准品配成系列质量浓度20份：0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1 100、1 200、1 300、1 400、1500、1 600、1 700、1 800、1 900 pg/mL。2)绘制HBsAg标准曲线。上述每一HBsAg标准品系列质量浓度分别用10条量子点标记的HBsAg免疫层析试条于相同条件下检测10次，分别读得其检测带光密度值(OD检测带)与质控带光密度值(OD质控带)，计算平均值和OD检测带/(OD检测带+OD质控带)比值。以HBsAg标准品系列质量浓度作X轴，以每一HBsAg标准品系列质量浓度对应求得的OD检测带/(OD检测带+OD质控带)比值作Y轴绘制标准曲线。

图4为血清肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特异抗原(PSA)标准曲线(示一检多项，其中：X轴为AFP、CEA和PSA标准品系列质量浓度；Y轴为AFP、CEA和PSA标准品系列质量浓度对应求得的OD检测带/OD质控带比值)。制备方法：1)标准品系列质量浓度配制。用1∶10稀释的正常人血清(以pH=7.2， 0.03 mol/L PB缓冲液稀释)作稀释液，将AFP、CEA和PSA标准品分别按0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000、1 100、1 200、1 300、1 400、1 500、1 600、1 700、1 800、1 900 pg/mL配成系列质量浓度各20份。2)绘制肿瘤标志物标准曲线。每份肿瘤标志物标准品系列质量浓度分别用10条量子点标记的肿瘤标志物一检多项免疫层析试条在相同条件下检测10次，分别读得其检测带光密度值(OD检测带)与质控带光密度值(OD质控带)，得到平均值和OD检测带/OD质控带比值。以每一肿瘤标志物标准品系列质量浓度作X轴，以各肿瘤标志物标准品系列质量浓度对应求得的OD检测带/OD质控带比值作Y轴绘制标准曲线。

1.3.2 被检物标准曲线存贮

编写标准曲线软件。将该标准曲线软件与试条质控带光密度参考监控值(即标准曲线制作时得到的试条质控带光密度值OD质控带)存贮于IC卡上。图5为量子点标记的HBsAg荧光光谱：I为检测带的HBsAg光谱峰，Ⅱ为质控带的质控物光谱峰。图6为量子点标记的血清肿瘤标志物AFP、CEA和PSA荧光光谱：Ⅰ为检测带的AFP光谱峰，Ⅱ为检测带的CEA光谱峰，Ⅲ为检测带的PSA光谱峰，Ⅳ为质控带的质控物光谱峰。

2 系统操作使用方法

1)开机。2)插入IC卡。3)将加有待测样品的量子点免疫层析试条放于试条槽中。4)键盘读入检测参数，包括IC卡上存贮的被检物标准曲线和质控带光密度参考监控值、系统自检扫描时间、样品名称、样品编号、试条批号、试条效期、检测者姓名、检测日期、IC卡密码等。之后，系统自动开始自检计时。5)系统自检结束，系统自动开始样品检测。6)显示检测结果。

3 评价

3.1 量子点免疫层析

免疫层析是在酶联免疫吸附方法(ELISA)的基础上发展起来的一种免疫标记技术。该技术简单、快速，几分钟就能获得检测结果，被称为“浓缩的ELISA”。目前的免疫层析技术主要采用胶体金标记试条进行样品检测[9-12]，不足之处是：该技术检测样品只能定性检测，难以定量和多元指标检测。量子点具有荧光发光亮度高、激发谱线宽、发射谱线窄、荧光寿命长、Stokes位移大等特点，不同粒径、成分和结构的量子点能产生不同特征波长反射荧光，且产生的特征波长反射荧光光谱不交叠[13-16]。选用不同粒径、成分和结构的量子点作为荧光标记物分别标记试条被检物检测相关分子，通过一个适当延迟时间检测其发出的特征波长荧光强度，不仅能有效消除背景荧光干扰(如生物体自荧光干扰和分析用材料产生的本底荧光干扰等)，而且能准确实现样品多元指标同时快速定量检测。目前，量子点免疫层析试条用于生物医学样品检测已见专利文献报道[17-19]，但基于量子点免疫层析试条的定量检测仪器未见报道，本文工作属于先例。

3.2 系统工作机制

量子点标记物在试条上虹吸渗移产生反射荧光的过程属于动态反应过程。不同量子点试条或不同批次试条，由于制备工艺和原材料选用等差异，其产品质量不会完全相同，势必影响被检物浓度的精确测定。例如，制备试条所用的纤维素膜来源不同、膜滤孔大小不同、试条厚度不同等有可能使反应物在试条上以不同的虹吸渗移速率前行，有的反应物甚至可能被滞留在试条检测带和质控带之前的试条渗移途中[20]。此外，检测样品时所处环境条件不可能完全一致，也有可能影响到试条反应物在试条上的渗移速率，从而影响到被检物浓度的精确测定。本系统采用量子点层析试条随配IC卡存贮被检物相应标准曲线以定量检测被检物、并由IC卡同时提供试条质控带光密度参考监控值以提示反应成败，能较好地解决上述问题。IC卡即插即用，存贮的被检物标准曲线和试条质控带光密度参考监控值可随试条批间差异适时灵活校准，操作不仅简便，而且提高了检测的精确性和灵活性。样品检测时，IC 卡存贮的试条质控带光密度参考监控值会提示试条反应过程是否成立、检测结果是否真实有效(试条反应失败时，检测过程得到的OD质控带值与IC卡上存贮的相应OD质控带值会产生极大统计学误差)。IC 卡还可作临时存储器存贮储检测结果，并可打印、保存和移携。

3.3 系统应用

本系统应用广泛，系统硬件可持续共用。不同待检样品检测时，仅需更换相应量子点免疫层析试条和相应IC卡即可实现样品多指标定量检测。试条为一次性使用品，IC卡为同批次试条配套品。待检样品可以是来自临床或非临床的血液(包括全血、血清、血浆)、体液、尿液、唾液、生殖道分泌物或其他液态样品或粘稠状样品。

4 结语

本文介绍了一种基于CCD的量子点免疫层析试条的样品定量检测系统。该系统不需要其他仪器设备、试剂以及复杂的操作就能快速准确定量检测生物医学样品多指标，具有检测快速、灵敏度高、结果客观、操作简单、使用灵活等优点，在生物医学样品检测方面具有广阔应用前景。本系统已申请获得国家专利[21]。

[1] MICHALET X,PINAUD F,BENTOLILA L,et al.Quantum dots for live cells,in vivo imaging,and diagnostics[J].Science,2005,307(5 709)：538-544.

[2] MITCHELL G,MIRKIN C,LETSINGER R.Programmed assembly of DNA functionalized quantum dots[J].J Am Chem Soc,1999,121(35):8 122-8 123.

[3] BRUCHEZ M,MORONNE M,GIN P,et al.Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels[J].Science,1998,281(5 385):2 013-2 016.

[4] CHEN W,NIE S.Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection[J].Science,1998,281(5 385):2016-2 018.

[5] SUN B Q,XIE W Z,YI G S,et al. Microminiaturized immunoassays using quantum dots as fluorescent label by laser confocal scanning fluorescence detection[J].J Immunol Methods,2001,249(1-2):85-89.

[6] GOLDMAN E,CLAPP A,ANDERSON G,et al.Multiplexed toxin analysis using four colors of quantum dot fluororeagents[J].Anal Chem,2004,76(3):684-688.

[7] LARSON D,ZIPFEL W,WILLIAMS R,et al.Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo[J].Science,2003, 300(5 624):1 434-1 436.

[8] GAO X,CUI Y,LEVENSON R,et al.In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots[J].Nat Biotechnol,2004,22(8):969-976.

[9] YANG S Z, YANG J F, ZHANG G P, et al. Development of an immunochromatographic strip for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus serotype O[J]. J Virol Methods, 2010,165(2):139-144.

[10] 林彤,邵军军,丛国正,等.Asia1型口蹄疫病毒胶体金免疫层析检测方法的建立[J].生物工程学报,2009,25(5):767-772.

[11] PENG F H,WANG Z,ZHANG S H,et al.Development of an immunochromatographic strip for rapid detection of H9 subtype avian influenza viruses[J].Clin Vaccine Immunol,2008,15(3):569-574.

[12] XU C L,WANG H T,PENG C F,et al.Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of diethylstilbestrol residues[J].Biomed Chromatogr,2006,20(12):1 390-1 404.

[13] MICHALET X,PINAUD F,LACOSTE T,et al.Properties of fluorescent semiconductor nanocrystals and their application to biogical labeling[J].Singe Mol,2001,2(4):261-276.

[14] ALIVISATOS A.Colloidal quantum dots.From scaling laws to biological applications[J].Pure Appl Chem,2000,72(12):3-10.

[15] HAN M Y,GAO X H,SU J,et al.Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed opitcal coding of biomolecules[J].Nat Biotechnol,2001,19(7):631-635.

[16] ROSENTHAL S.Bar1-coding biomolecules with fluorescent nanocrystals[J].Nat Biotechnol,2001,19(7):621-622.

[17] 高峰,贺蓉,崔大祥,等.量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法.中国,200610024086.7[P].2006-08-02.

[18] 胡华军,洪治,刘军,等.药物残留竞争型量子点标记免疫层析试纸条及其观测装置.中国,200810227473.X[P].2009-10-07.

[19] 沈鹤柏,方菲.量子点标记免疫层析试纸快速检测膀胱癌方法.中国,200810041133.8[P].2009-01-07.

[20] 余琨,周蕾,黄立华,等.一维多重检测上转换磷光生物传感器.中国,200610027354.0[P].2006-12-13.

[21] 马义才,顾敏,马灵.量子点标记试条定量检测系统及其检测方法.中国,ZL200810186010.3[P].2009-08-26.

DesignofaQuantitativeSystemforQuantumDotImmunochromatographyStrip

MAYicai*，HOUFei，WANGChunying

(School of Life Science and Technology, University of Electronic Science and Technology, Chengdu 610054, China)

A novel quantitative system for quantum dot immunochromatography strip was designed. It is composed of quantum dot immunochromatography strip, strip rack, scanning system, charge coupled device (CCD), signal amplifier, analog/digital converter(A/D), micro chip unit (MCU), display device, printer, keyboard and an IC card used together with the strip. The MCU controls the movement of the strip rack after reading the parameters of the IC card, making the optical fiber probes of the scanning system automatically scan the strip. The collected characteristic reflection fluorescence is transmitted to the MCU for optical signal identification and concentration calculation through the CCD, the signal amplifier and the analog/digital converter. The display device shows test results. This new system can implement multi-component quantitative detections for sample. It has the characteristic of rapid detection, high sensitivity, objective results and flexible use, thus having a broad prospect for application in biological medicine.

quantum dot(QD); quantitative system; immunochromatography strip; charge coupled device (CCD)；design

2013-10-30

四川省科技支撑计划“乙肝两对半快速检测笔研制”(2010SZ0061)；成都市科技攻关计划“笔式血液传染病快速联检试剂盒研制”(10GGYB080SF-023)

马义才(1956- )，男(汉族)，四川宜宾人，副教授，硕士，研究方向：分子标记与检测，通信作者邮箱：scmyc@uestc.edu.cn。

侯飞(1985- )，男(汉族)，湖北人，在读硕士研究生，研究方向：分子标记与检测。

TH77

A

2095-5383(2013)04-0010-04