鸭疱疹病毒1型的gB蛋白截短表达及其ELISA检测

马 力, 杨丽梅, 郭时金, 沈志强*, 李 峰, 张 颖, 徐倩倩, 张志美, 王艳萍

(1. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州256600；2. 山东绿都安特动物药业有限公司，山东，滨州256600)

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)又名鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)、鸭疱疹病毒1型(Anatid herpesivirus 1，AnHV-1)是鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)，俗称鸭瘟(Duck plague，DP)的致病原[1-2]。鸭病毒性肠炎自1923年在荷兰首次暴发后，逐渐向全球范围内扩散，现已呈世界范围内流行，我国于1957年在广州首次发现，现主要流行于华东、华中、华南等养鸭密集地区。该病具有较高的发病率与死亡率，是阻碍我国养鸭业健康发展的主要疫病之一，每年都给国内家禽养殖业带来了巨大的经济损失，世界动物卫生组织将该病列为B类动物疫病，我国农业部兽医局将其确定为三类动物传染病[3-8]。鸭肠炎病毒是疱疹病毒科(Herpesviridae)α-疱疹病毒亚科(Alpha-herpesvirinae)的典型代表病毒，是具有核衣壳和囊膜的双股DNA病毒[9-10]。其中gB蛋白是DEV最保守的囊膜蛋白，为病毒吸附、穿入、融合细胞以及细胞间传播的必需蛋白，同时其表面的抗原决定簇能够诱导机体产生高水平的体液免疫反应，具有良好的反应活性及免疫原性，在疱疹病毒的诊断、防治等方面具有巨大的应用价值和广阔的应用前景[11-12]。鉴于此，本研究对gB基因进行了截短表达、纯化以及活性鉴定，并初步建立了检测鸭肠炎病毒抗体的间接ELISA诊断方法，为鸭肠炎病毒诊断试剂盒的开发应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌毒株、载体及血清

克隆菌株DH5α感受态细胞、表达菌株BL21(DE3) 感受态细胞由山东省滨州兽医生物技术重点实验室制备并保存；鸭肠炎病毒(DEV)弱毒疫苗株由山东绿都生物科技有限公司提供；克隆载体pMD18-T购自宝生物(大连)工程有限公司；原核表达载体pET30a由山东省滨州兽医生物技术重点实验室保存；鸭肠炎病毒阳性及阴性血清购自中国兽医药品监察管理所。

1.2 试 剂

Taq DNA 聚合酶、BamH I与Hind III内切酶、T4 DNA连接酶购自宝生物(大连)工程有限公司；蛋白酶K购自生工生物工程(上海)股份有限公司；凝胶回收试剂盒、病毒基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒北京百泰克生物技术有限公司；镍离子亲和层析柱购自GE Healthcare。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank公布的DEV基因组序列，用DNAstar生物学软件对DEV gB基因的抗原区、亲水区及表面展示概率进行分析，利用oligo6.2设计扩增gB基因的一对引物(加线部分表示引入的酶切位点)P1 5'-3'ATAGGATCCGGCTATGGACCAACCGAATCT；P2 5'-3' ATTCAAGCTTCTCTGCCCATAGAACGCTCTC，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 病毒的增殖

将DEV经绒毛尿囊膜接种10日龄鸭胚，收集72～120 h含痘斑的鸭胚尿囊膜和鸭胚尿囊液，将尿囊膜剪碎研磨后用尿囊液制成悬液，反复冻融3次，然后于4 ℃ 12 000 r/min 离心20 min，取上清，置-20 ℃保存备用。

1.5 病毒基因组DNA的提取

取上述保存病毒液500 μL，按病毒基因组DNA提取试剂盒的使用说明提取DEV基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.6 gB基因的PCR扩增、克隆与鉴定

以提取的病毒基因组DNA为模板，用设计的引物PCR扩增gB基因，PCR反应条件为：94 ℃ 5 min预变性、94 ℃ l min、55 ℃ l min、72 ℃ l min，共进行30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。PCR扩增产物经胶回收试剂盒纯化后连接至pMD18-T载体，转化克隆菌株DH5α感受态细胞，用质粒提取试剂盒提取质粒，进行PCR及BamH I/Hind III双酶切鉴定，将鉴定正确的阳性重组质粒命名为pMD18-T-gB，将其送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。

1.7 gB基因原核表达载体的构建与鉴定

利用测序鉴定正确的pMD18-T-gB阳性重组质粒经BamH I/Hind III双酶切后，回收855 bp的gB基因片段，用T4 DNA连接酶于22 ℃过夜连接至经BamH I/Hind III双酶切的pET30a原核表达载体中，转化克隆菌株DH5α感受态细胞，用质粒提取试剂盒提取质粒，进行PCR及BamH I/Hind III双酶切鉴定，将鉴定正确的阳性重组质粒命名为pET30a-gB。

1.8 pET30a-gB重组蛋白表达条件的优化

将鉴定正确的pET30a-gB阳性重组质粒转化表达菌株BL21(DE3) 感受态细胞，采用不同诱导剂浓度、不同时间、不同温度诱导pET30a-gB重组蛋白的表达。经SDS-PAGE电泳分析，确定最佳的诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度。

1.9 pET30a-gB重组蛋白表达形式的鉴定

以最佳诱导条件表达后，用超声波裂解细胞。超声波作用5 s，间隔5s，共作用60次。然后以12 000 r/min离心20 min，分别收集沉淀与上清进行SDS-PAGE电泳分析检测，鉴定目的蛋白是以包涵体形式存在于沉淀中，还是以可溶性形式存在于上清中。

1.10 pET30a-gB重组蛋白的纯化

对以包涵体形式表达的重组蛋白采用不同浓度的尿素进行变性处理，确定能够溶解包涵体的最适尿素浓度。包涵体溶解后采用镍离子亲和层析法纯化，纯化蛋白透析复性，对复性后的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳检测分析，Bradford法测定纯化蛋白的浓度。

1.11 pET30a-gB重组蛋白的Western blot活性检测

依次取纯化的pET30a-gB重组蛋白、pET30a空载体诱导表达菌、纯化的pET30a-gB重组蛋白和pET30a空载体诱导表达菌进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后转印至硝酸纤维素膜上，过夜封闭后，沿硝酸纤维素膜中间剪开，分别与1∶100倍稀释的鸭肠炎病毒阳性血清、阴性血清反应，洗涤后，与1∶4 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸭IgG反应，洗涤后，在3'-二氨基联苯胺缓冲液中进行显色。

1.12 间接ELISA检测方法的初步建立与应用

以纯化的重组gB蛋白作为包被抗原、鸭肠炎病毒阳性与阴性血清蛋白作为一抗、HRP标记兔抗鸭酶标抗体为二抗，采用方阵滴定法测定抗原抗体的最佳工作浓度与作用时间，以建立的间接ELISA检测方法，与病毒中和试验同时对86份鸭血清进行检测，计算二者的符合率。

2 结 果

2.1 gB基因PCR扩增结果

如图1所示，gB基因PCR扩增产物经凝胶成像扫描分析系统扫描显示在位于855 bp大小处可见的特异性DNA扩增片段，与试验的预期结果相一致。

2.2 gB基因克隆与鉴定结果

如图2所示，构建的pMD18-T-gB质粒经PCR鉴定可明显扩增出855 bp DNA片段，经BamH I/Hind III双酶切鉴定可明显切出855 bp DNA片段，重组质粒pMD18-T-gB的测序表明插入T载体中的序列与参考毒株相同。

图1 PCR扩增结果M.DNA标准DL 2000;1.gB基因PCR扩增产物; 2.对照Fig.1 Result of PCR Amplification

M.DNA Marker DL 2000; 1.Product of PCR;2.control

图2 克隆载体的鉴定M.DNA标准DL 2000;1.对照;2.PCR鉴定;3.质粒pMD-gB BamH I/Hind III酶切Fig.2 Identification of recombinant cloning vector

M.DNA Marker DL 2000; 1.Control;2.Product of recombinant plasmid PCR;3.Recombinant plasmid digested by BamH I/Hind III

2.3 gB基因表达载体的鉴定结果

如图3所示，构建的pET30a-gB重组质粒经PCR鉴定可明显扩增出855 bp DNA片段，经BamH I/Hind III双酶切鉴定可明显切出约5900 bp和855 bp两条片段，与预期结果相符，表明表达载体构建成功。

2.4 pET30a-gB重组蛋白的最佳表达条件的确定

经SDS-PAGE电泳确定重组蛋白的最佳诱导温度为 37 ℃、最佳诱导剂浓度为 1.0 mmol/L、最佳诱导时间为5 h，所表达蛋白的分子量约为39 ku，与预期大小相符。

2.5 pET30a-gB重组蛋白表达形式的鉴定结果

以最佳条件诱导表达后，超声裂解细胞，分别收集沉淀及上清进行SDS-PAGE电泳检测，得到pET30a-gB重组蛋白是以包涵体形式表达的见图4。

图3 表达载体的鉴定M1.DNA标准DL15 000; M2.DNA标准DL 2 000;1.对照;2.PCR产物;3.质粒pET30a-gB经BamH I/HindIII酶切;4.pET30a载体BamH I/Hind III酶切Fig.3 Identification of recombinant expression vectorM1.DNA Marker DL 15 000;M2.DNA MarkerDL 2 000;1.Control;2.Product of recombinant expressionvector PCR;3.Recombinant expression vector digestedby BamH I/Hind IIII.4.pET30a vector digestedby BamH I/Hind III

图4 重组蛋白的SDS-PAGE分析M.蛋白分子质量标准;1.pET30a表达产物对照;2.pET30a-gB未诱导对照;3.pET30a-gB表达产物;4.超声破碎后上清;5.超声破碎后沉淀 Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombination protein

M.Protein molecular weight Marker;1.Expression product of pET30a;2.Non induced control of pET30a-gB；3.Expression product of pET30a-gB;4.Supernatant after ultrasonic disruption; 5.Pellets after ultrasonic disruption

2.6 pET30a-gB重组蛋白的纯化

2.6.1 包涵体蛋白的变性处理 以2、4、5、6、8 mol/L不同浓度尿素溶解包涵体，如图5所示，在尿素为4 mol/L时，包涵体中有极少量的一部分开始溶解，8 mol/L时包涵体完全溶解。最后确定用4 mol/L尿素洗涤包涵体，用8 mol/L尿素溶解包涵体。

2.6.2 包涵体溶解后的纯化与复性 包涵体溶解后，采用镍离子亲和层析柱对其进行纯化，对纯化后的蛋白采用6M、4M、2M尿素及PBS进行梯度透析复性，对复性前后的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示目的蛋白得到了纯化见(图6)，Bradford法测定纯化蛋白的浓度为0.516 mg/mL。

2.7 pET30a-gB重组蛋白的Western blot活性鉴定

如图7所示，pET30a-gB重组纯化蛋白能与鸭肠炎病毒阳性血清发生特异性反应，而与鸭肠炎病毒阴性血清不发生反应，同时pET30a空载体诱导表达菌与鸭肠炎病毒阳性血清、阴性血清均不发生反应，pET30a-gB重组纯化蛋白表现出了良好的活性与特异性。

2.8 间接ELISA检测方法的建立与应用结果

经过方阵滴定试验确定重组抗原最佳包被浓度为2.58 μg/mL；血清最佳稀释度为1∶100，酶标二抗最佳工作浓度为1∶4000，最佳作用时间为37 ℃ 1 h，以建立的间接ELISA检测方法与病毒中和试验检测86份鸭血清样品，间接ELISA检测出阳性62份，阴性24份；病毒中和试验检测出阳性60份，阴性26份，二者的符合率为97.67 %。

图5 包涵体用不同浓度尿素的溶解分析1-2.包涵体用2M尿素溶解后的沉淀、上清；3-4.包涵体用4M尿素溶解后的沉淀、上清;5-6.包涵体用5M尿素溶解后的沉淀、上清;7-8.为包涵体用6M尿素溶解后的沉淀、上清;9-10.为包涵体用8M尿素溶解后的沉淀、上清Fig.5 SDS-PAGE analysis after inclusion body resolve withdifferent contents of urea

1-2.Deposition and supernatant of inclusion body dealt with 2M urea;3-4.Deposition and supernatant of inclusion body dealt with 4M urea; 5-6.Deposition and supernatant of inclusion body dealt with 5M urea;7-8.Deposition and supernatant of inclusion body dealt with 6M urea; 9-10.Deposition and supernatant of inclusion body dealt with 8M urea

图6 重组蛋白纯化复性SDS-PAGE分析M.蛋白分子质量标准;1.表达产物对照;2.纯化后蛋白;3.复性后蛋白Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified protein andrenaturated protein

M.Protein molecular weight Marker;1.Total protein in recombinantE.coli;2.Purified protein;3.Renaturated protein

图7 重组蛋白的Western blot活性鉴定1.纯化蛋白与阳性血清作用;2.pET30a表达菌与阳性血清作用;3.纯化蛋白与阴性血清作用; 4.pET30a表达菌与阴性血清作用Fig.7 Western blot of expressed products

1.Purified protein react with positive serum;2.Control of pET30a with positive serum.3.Purified protein react with negative serum;4.Control of pET30a with negative serum.

3 讨 论

目前针对DEV特异性抗体的检测方法有多种，其中病毒中和试验(VN)是世界动物卫生组织(OIE)指定的DEV特异抗体的检测方法，但是VN操作繁琐，判定结果时间长，不适于急性病程以及大批样本的检测。另外也有间接免疫荧光(IFA)的报道，但是IFA具有结果判定的客观性不足，技术程序较为复杂，染色具有非特异性，需要在专业实验室内进行等缺点。而酶联免疫吸附试验(ELISA)自1971年Engval等建立以来，就以其简便、快速、敏感、安全、可自动化、使用仪器少等优点而被广泛应用于畜禽传染病抗原抗体的检测。齐雪峰等[13]、闫虹光等[14]建立了检测鸭肠炎病毒的间接ELISA方法与试剂盒，但因使用全病毒作为包被抗原，在制备有效的诊断抗原方面存在一定的困难，由于受病毒培养和纯化等方面的技术限制，全病毒抗原纯度有限，制备过程繁琐以及缺少标准化，一定程度上影响了检测的准确性，故基因工程技术表达的人工抗原逐步成为研究的热点。囊膜糖蛋白gB是疱疹病毒科中主要的免疫原性蛋白，目前疱疹病毒的疫苗与诊断试剂大多数是针对gB蛋白的抗原表位，王文洁等[12]将DNAStar分析与筛选出鸭病毒性肠炎病毒gB基因的两段主要抗原区域进行了原核表达，Western-bloting与免疫鼠血清ELISA抗体检测结果表明表达的gB重组蛋白具有良好的免疫原性， 马波等[15]随后克隆了gB胞浆区基因片段，经原核系统表达后，Western-blot检测表明融合蛋白具有良好的反应活性。本研究用DNAstar生物学软件对DEV gB基因的抗原区、亲水区及表面展示概率进行分析，选择主要抗原区域进行了原核表达，western blot检测表明重组蛋白具有良好的反应活性，以该蛋白作为诊断抗原，初步建立了检测鸭肠炎病毒抗体的间接ELISA诊断方法，该方法与病毒中和试验的符合率达97.67 %，具有良好的特异性、敏感性。针对目前所建立的检测DEV血清抗体的ELISA方法存在的诸多问题，探索建立灵敏特异具实用价值的DEV ELISA检测方法对我国DEV的控制消灭及流行病学调查具有重要的意义。这也正是本文所进行的探索性试验，我们利用大肠杆菌表达的gB蛋白片段作为DEV诊断抗原初步建立了间接ELISA检测方法，为进一步开发商品化试剂盒奠定了基础。

参考文献:

[1] 张 荷, 毛君婷, 杨 颖, 等. 鸭肠炎病毒核衣壳蛋白受体的筛选与鉴定[J].病毒学报,2012,28(1):63-66.

[2] Mondal B, Rasool T J, Ram H, et al. Propagation of vaccine strain of duck enteritis virus in a cell line of duck origin as an alternative production system to propagation in embryonated egg [J]. Biologicals,2010, 38(3):401-406.

[3] Baudet A E R F. Mortality in ducks in the Netherlands caused by a filtrable virus; fowl plague[J].Tijdschr Diergeneeskd, 1923, 50:455-459.

[4] Hall S A, Simmons J R. Duck plague (duck virus enteritis) in Britain[J]. Vet Rec, 1972, 90(24): 691.

[5] Gough R E, Hansen W R. Characterization of a herpesvirus isolated from domestic geese in Australia[J]. Avian Pathol,2000, 29(5):417-422.

[6] Shawky S, Schat K A. Latency sites and reactivation of duck enteritis virus[J]. Avian Dis, 2002, 46(2):308-313.

[7] 黄引贤. 拟鸭瘟的研究[J]. 华南农学院学报,1959(1):67-68.

[8] 柳金雄, 陈普成, 邬 丽, 等. 鸭病毒性肠炎病毒基因组异构体的研究[J].中国预防兽医学报,2011, 28(8):658-660.

[9] Wu Y, Cheng A, Wang M, et al. Comparative genomic analysis of duck enteritis virus strains[J]. J Virol, 2012,86(24):13 841-13 842.

[10] Wang J, Hoper D, Beer M, et al. Complete genome sequence of virulent duck enteritis virus (DEV) strain 2085 and comparison with genome sequences of virulent and attenuated DEV strains[J]. Virus Res, 2011, 160(1,2):316-325.

[11] 马 波, 刘峰源, 张 扬, 等.鸭肠炎病毒gB基因的分子特征[J].生物技术通报, 2009(9):101-106.

[12] 王文洁，唐泰山， 张常印，等. 鸭病毒性肠炎gB基因的原核表达及产物的抗原性分析[J].畜牧与兽医, 2008,40(10):5-10.

[13] 齐雪峰,程安春, 汪铭书, 等. 鸭瘟病毒抗体间接ELISA检测试剂盒的研制[J].中国兽医科学, 2007, 37(08):690-694.

[14] 闫虹光, 曲连东, 刘家森, 等. 鸭病毒性肠炎间接ELISA诊断方法的建立及应用[J]. 中国预防兽医学报, 2008,3(09):721-726.

[15] 马 波, 李洪涛, 刘峰源, 等. 鸭肠炎病毒gB胞浆区基因片段的克隆及原核表达[J].中国兽医科学2011,41(6):607-609.