HPLC法测定恩诺沙星可溶性粉含量

谢玉荣,吴少玲,李 强,张 滢

(海南省兽药饲料监察所, 海南 海口 570203)

恩诺沙星作为动物专用的杀菌性广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阴性菌、部分革兰氏阳性菌及某些支原体、衣原体等均有效，已广泛用于猪、牛、禽、犬、猫和水生动物的敏感细菌及支原体所致的消化系统、呼吸系统、泌尿系统及皮肤软组织的各种感染性疾病[1]。恩诺沙星可溶性粉作为恩诺沙星的一种主要剂型，主要用于鸡大肠杆菌病、鸡白痢、鸡巴氏杆菌病和鸡败血性支原体病等[2]。现今较多学者运用紫外分光光度法测定恩诺沙星的含量，如赵成等[3]运用紫外分光光度法测定恩诺沙星注射混悬剂的含量，又如张慧辉等[4]运用紫外分光光度法测定恩诺沙星纳米乳的含量测定。HPLC法是药物含量测定应用最为广泛的方法，本文首次考察HPLC法[5]是否适用于恩诺沙星可溶性粉的含量测定，并将测定结果与《兽药质量标准》2003年版中紫外分光光度法[6]的测定结果比较，证实该法准确可行。

1 材料与方法

1.1 材 料

Waters 2695 型高效液相色谱仪，2489 紫外检测器；岛津 UV-160A型紫外分光光度计；恩诺沙星对照品(中国兽医药品监察所，含量99.9 %，批号H0081206)；恩诺沙星可溶性粉(1)海南育奇药业，规格10 %，批号120701；(2)广州燕唐生物科技有限公司，规格2.5 %，批号20121201；(3)河北远征药业有限公司，规格2.5 %，批号12090322；(4)广西神达工贸有限公司神达兽药(原料)厂，规格2.5 %，批号2012.1.1.03；以下用编号表示)。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry C18柱(4.6 × 150 mm，5 μm)，流动相为0.025 mol/L磷酸(用三乙胺调节pH至3.0)- 乙腈(83∶17)，检测波长为278 nm，柱温25 ℃, 流速 1.0 mL/min。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 对照品溶液的制备 取105 ℃干燥至恒重的恩诺沙星对照品25 mg，精密称定，置50 mL的量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀；精密量取5 mL至50 mL量瓶中，加流动相定容稀释制成50 μg/mL的对照品溶液。

1.2.2.2 供试品溶液的制备 取恩诺沙星可溶性粉适量(约相当于恩诺沙星25 mg)，精密称定，同对照品方法制成50 μg/mL 的供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 系统适应性试验

分别取对照品溶液、供试品溶液10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，如图1所示。理论塔板数为5 000左右，均大于2 500，保留时间约为4.5 min。

2.2 线性关系试验

取105 ℃干燥至恒重的恩诺沙星对照品50 mg，精密称定，置250 mL的量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为储备液。精密吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL分别置于10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即制得20、30、40、50、60、70、80 μg/mL的系列对照品溶液，依次取10 μL进样记录色谱图。以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，得回归方程为：A=69376C-32435(n=7，r=0.9998)，如图2所示。表明在20～80 μg/mL的范围内，恩诺沙星浓度与峰面积呈现良好的线性关系。

图1 A和B分别为恩诺沙星对照品及恩诺沙星可溶性粉的色谱图
Fig.1 A and B are the chromatogram for enrofloxacin
standard and enrofloxacin soluble powder

图2 恩诺沙星线性曲线图Fig.2 Linear curve of enrofloxacin

2.3 重复性试验

取恩诺沙星可溶性粉(以海南育奇药业有限公司产品进行考察)，按1.2.2.1制备5份供试品溶液，测定供试品中恩诺沙星的含量为98.2 %， RSD为0.76 %，表明该法的重复性良好。

2.4 检测限与定量限试验

取1.2.2.1中的恩诺沙星对照品溶液，用流动相逐级稀释，记录色谱图，以信噪比为3:1时测定检测限，信噪比为10:1时测定定量限。信噪比为3:1时测得检测限为15 ng/mL，信噪比为10:1时定量限为50 ng/mL。

2.5 专属性试验

以海南育奇药业有限公司产品为例，通过测定恩诺沙星的主要降解产物环丙沙星和空白辅料，考察本法的专属性。取盐酸环丙沙星对照品适量精密测定，按照1.2.2.1中的方法制成50 μg/mL的溶液；另取空白辅料(约与25 mg恩诺沙星相当的处方辅料量)按照1.2.2.1中的方法制成相应的空白辅料溶液。分别取上述两种溶液进样，记录色谱图如图3所示。由图3可看出，恩诺沙星保留时间约为4.4 min，主要杂质盐酸环丙沙星保留时间约为3.4 min，两者均在色谱柱上有适当保留，且峰形良好；空白辅料不出现与恩诺沙星及盐酸环丙沙星保留时间一致或相融合的峰，因而辅料不干扰恩诺沙星及杂质的测定。

图3 恩诺沙星可溶性粉专属性试验Fig.3 Specificity test of enrofloxacin soluble powder

2.6 耐用性试验

本试验通过改变HPLC法的柱温、流动相的比例、流速和pH，以及采用不同的色谱柱、不同仪器考察本法的耐用性。将考察结果与本法结果比较，结果如表1所示，表1说明本法耐用性良好。

表1 耐用性试验Table 1 Durability Test

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液(对海南育奇药业有限公司产品进行考察)，在室温下放置，分别于0、1、3、5 h时进样测定恩诺沙星含量，得RSD为0.40 %，表明供试品在5 h内仍保持其稳定性，不影响含量测定结果。

2.8 回收加样试验

取海南育奇药业有限公司供试品约0.127 g(约相当于12.5 mg恩诺沙星)9份，置25 mL的量瓶中，每三份分别加入标示量80 %、100 %、120 % 的对照品，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5 mL至100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度制成理论浓度在线性范围内的供试品溶液，依次取10 μL进样，计算回收率，所得结果见表2。由表2可知，回收率平均值为99.3 %，RSD为0.40 %，表明本法准确度良好。

表2 回收加样试验Table 2 Sample recovery test

2.9 供试品含量测定

运用上述HPLC法和紫外分光光度法[3]对来自四个不同厂家的恩诺沙星可溶性粉进行含量测定，将两法测定结果进行比较，所得结果见表3。HPLC法与紫外分光光度法测定的结果相近，说明HPLC法准确可靠。

3 讨 论

本研究运用HPLC法测定恩诺沙星可溶性粉的含量，并对该法进行较为完整的方法学研究。在系统适应性试验中，恩诺沙星可溶性粉出峰时间为4.5 min，在短柱上能有极佳的保留，无论对照品或供试品，理论塔板数均大于5 000，远远大于规定的2 500，峰形好，无拖尾，系统适应性试验的各项参数都较为理想；回收加样试验与重复性试验结果表明该法具有较好的准确度和精密度；专属性试验说明该法抗干扰程度大，辅料及主要杂质盐酸环丙沙星存在时，在得到有效分离的同时对恩诺沙星测定结果几无干扰；稳定性试验结果说明恩诺沙星可溶性粉的化学性质稳定，在5 h内检测结果变化微小，无降解或变质现象产生；耐用性试验则进一步验证了该法在一定范围内改变柱温、流动相比例、流速、流动相pH值，甚至色谱柱、液相色谱仪时，检测结果的变化不明显，说明该法耐用性良好；此外还确定了该法的线性范围、检测限和定量限，为HPLC测定恩诺沙星可溶性粉的含量提供了可靠的试验依据。

表3 HPLC法和紫外分光光度法含量测定结果Table 3 The assay results of HPLC and UV spectrophotometry

4 结 论

紫外分光光度法易受溶剂和杂质的干扰，恩诺沙星降解产物环丙沙星在271 nm波长处存在较大的紫外吸收，对于恩诺沙星的定量干扰较大，导致结果偏离，因此该法不适用于成分复杂的样品检测。HPLC法相比于紫外分光光度法，能够分离无关物质，同时避免某些助溶剂或辅料对测定结果的影响，且具有良好的重复性、专属性、耐用性和准确度，能更有效地控制恩诺沙星可溶性粉的质量。

参考文献：

[1] 应翔宇,杨永胜.兽用新型抗菌药物-恩诺沙星[J].中国兽药杂志, 1995,29(3):53-56.

[2] 王海花,郭宏伟,唐光武.复方盐酸恩诺沙星可溶性粉对实验性鸡大肠杆菌病的疗效试验[J].家畜生态学报,2010,31(1):93-94.

[3] 赵 成.恩诺沙星注射混悬剂的研制及药物含量测定研究[J].中国卫生产业,2012,9(15):29.

[4] 张慧辉,杨雪峰,胡建和,等.紫外分光光度法测定恩诺沙星纳米乳含量方法的建立[J].广东农业科学,2013(3):92-94.

[5] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[M].北京:中国农业出版社，2010:222-223.

[6] 中华人民共和国农业部.兽药质量标准[M].北京:中华人民共和国农业部，2003：66.