四妙勇安汤合失笑散对急性心肌梗死模型大鼠VEGF表达的影响*

张淑芹 陶 红 刘翠文

（1.河北省秦皇岛市中医院，河北 秦皇岛 066000；2.河北省唐山市丰润区第二人民医院，河北 唐山 064000）

急性心肌梗死属中医学“胸痹”“、真心痛”等病证，笔者认为其基本病机特点为正气亏虚、毒瘀阻络。临床大量报道四妙勇安汤及失笑散治疗急性心肌梗死疗效显著［1-4］。本实验就四妙勇安汤合失笑散对内皮细胞生长因子表达的影响展开研究，以探讨其治疗急性心肌梗死的机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性健康Wistar大鼠60只，体质量180～220 g，清洁级。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号为CXX（京）2007-0001。

1.2 药物与试剂 四妙勇安汤合失笑散（由当归30 g，金银花 30 g，玄参 20 g，甘草 15 g，蒲黄 6 g，五灵脂 6 g，浓缩成2 g/mL的生药煎剂）：由本院中药制剂室提供。

1.3 仪器与试剂 TRIZOL Reagent（Invitrogen）；R Tmaster Mix，Taq DNA polymerase，引物及探针由大连宝生物公司提供。见表1。标准品质粒由上海基康生物科技有限公司提供。大鼠VEGF Elisa试剂盒，由武汉博士德生物科技有限公司提供，批号：EK0540。slan荧光定量PCR仪（上海宏石）。Bio-mini分光光度计（日本岛津）。550型酶标仪（美国伯乐）。

1.4 模型制备 建立大鼠急性心肌梗死模型。大鼠麻醉后仰位固定，从胸骨左侧第3、4肋间正中线旁开5 mm行纵向切口，将心脏轻轻挤出，于左心耳根部下方2～3 mm处穿线，结扎冠状动脉左前降支，建立心肌缺血模型。结扎后迅速将心脏还纳，关闭胸腔，恢复自主呼吸。手术前后记录心电图，以术后Ⅱ导联心电图ST段弓背向上抬高为模型复制成功的标志。术后连续3 d注射青霉素80万U／d以预防感染。假手术组只开胸穿线，不结扎冠脉，其余操作同上。

1.5 分组及给药 60只SD大鼠随机分为5组：四妙勇安汤合失笑散大、中、小剂量组、假手术组、模型组各12只。四妙勇安汤合失笑散大、中、小剂量组和模型组于手术前 6 d 开始灌胃，剂量分别为 28、14、7 g/（kg·d），第6日进行造模，对照组于相同时间给予灭菌蒸馏水2 mL灌胃。每日 2次，分别再灌胃 10 d［5］。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 实时荧光定量PCR检测VEGF mRNA的表达水平 取心肌组织组织，用Trizol法提取总RNA，检测RNA纯度及浓度。取纯度好的样品进行逆转录反应，10 μL反应体系，cDNA置-20℃保存备用。PCR反应体系为 25 μL：Taq 酶 12.5 μL，10 μΜ 上、 下游引物各0.5 μL，3 μΜ 荧光探针 1 μL， 模板 （cDNA）2 μL，补DEPC水至25 μL。反应条件为95℃预变性60 s，95℃10 s、6℃ 30 s扩增40个循环，在60℃读取荧光。每个样品设3个平行复孔取均值。用内参进行标准化处理后进行相对定量分析。

表1 引物及探针序列

1.6.2 ELISA法测定 耳中央动脉血清VEGF浓度。

2 结 果

2.1 大鼠心肌VEGF mRNA表达变化 见表2。结果表明，模型组VEGF mRNA表达水平较假手术组有升高（P＜0.05），其他各组较假手术组显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，四妙勇安汤合失笑散大、中剂量组VEGF mRNA表达水平显著升高（P＜0.01），小剂量组略有升高（P＞0.05）。

2.2 各组血清VEGF浓度变化 见表3。研究表明，模型组血清VEGF含量较假手术组有升高（P＜0.05），其他各组较假手术组显著升高（P＜0.01）；与模型组相比较，四妙勇安汤合失笑散大、中剂量组VEGF含量显著升高（P＜0.01），四妙勇安汤合失笑散小剂量组略有升高（P＞0.05）。

表2 各组大鼠心肌VEGF mRNA表达比较（）

表2 各组大鼠心肌VEGF mRNA表达比较（）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

表3 各组大鼠血清VEGF蛋白浓度比较（）

表3 各组大鼠血清VEGF蛋白浓度比较（）

3 讨 论

急性冠状动脉综合征是指急性心肌缺血引起的一组临床症状，包括ST段抬高心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死和不稳定型心绞痛，已成为临床常见的严重心血管疾病。其主要发病机制是在破裂的动脉粥样硬化斑块基础上形成血栓，进而完全或不完全堵塞冠状动脉，造成心肌急性缺血。

血管内皮细胞生长因子（VEGF）是一种特异作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，属于血小板源生长因子家族成员，是促血管生成的主要因素之一。VEGF及其受体在血管新生中起着最关键的作用，调控着内皮细胞的增殖、迁移、管腔形成等重要环节［6］。血清低水平的VEGF会造成急性心肌梗患者发生多种并发症的危险［7］。

四妙勇安汤具有滋阴养血，清毒祛瘀的功效。绿原酸和阿魏酸分别为金银花和当归的主要有效成分，具有心血管保护作用。失笑散属理血剂，由五灵脂和蒲黄两味药组成，具活血化瘀，散结止痛之功效，主治瘀血停滞。研究资料表明，活血化瘀中药可扩张血管口径，增加血流量，改善微循环和血液流变学，降低微血管内血细胞的聚集，延长凝血及血栓形成时间的作用。该类药物还可以促进VEGF及其他多种细胞因子表达［8-9］。

本实验结果提示：四妙勇安汤合失笑散可增高血清中VEGF含量；同时可上调心肌VEGF mRNA的表达，其中大剂量组的作用最好。所以四妙勇安汤合失笑散治疗心肌梗死的机制有可能是通过促进心肌梗死大鼠心肌VEGF的表达、分泌，从而促进梗死心肌血管新生。

［1］崔文利，杨明霞，梁春香.失笑散加味治疗冠心病心绞痛87例临床观察［J］.现代中西医结合杂志，2000，9（6）：510.

［2］刘海涛.加味四妙勇安汤治疗冠心病60例疗效观察［J］.甘肃中医，2005，18（7）：14-15.

［3］朱寅圣.四妙勇安汤合生脉饮治疗冠心病120例［J］.时珍国医国药，2007，18（11）：2824.

［4］单昌涛.失笑散加味治疗冠心病［J］.湖南中医杂志，2000，16（4）：31

［5］汪姗姗，李勇，范维琥，等.麝香保心丸对实验性心肌梗塞大鼠心脏的促血管生成作用［J］.中成药，2002，24（6）：446.

［6］Carrato A，Gallego-Plazas J，et al.Anti-VEGF therapy：a new approach to colorectal cancer therapy［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2006，6（10）：1385-1396.

［7］Matsudaira K，Maeda K，Okumura N，et al.Impact of low levels of vascular endothelial growth factor after myocardial infarction on 6-month clinical outcome.Results from the Nagoya Acute Myocardial Infarction Study［J］.Circ J 2012，76（6）：1509-1516.

［8］李强，孙建宁，夏晓晖.失笑散及其不同提取部位的药效学研究［J］.北京中医药大学学报，1999，22（3）：48-49.

［9］储永良.活血化瘀中药对血管内皮生长影子影响的研究进展［J］.中国中医药信息杂志，2006，13（8）：96-98.