重组腺病毒Ad-hBNP对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡因子及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响*

宋衍秋 赵莉莉 毛用敏 赵鸿铭 崔让庄

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）的病理机制为多种原因造成的心室功能减弱，心排出量下降，致心脏前后负荷增加。病变过程中伴随着交感神经系统、肾素-血管紧张素系统及神经内分泌-细胞因子系统的激活，并伴随着心肌细胞凋亡及心室重塑。B型利钠肽 （B-type natriuretic peptide，BNP）为左心室肌细胞合成并分泌的一种肽类激素，其主要作用是利钠利尿、扩张静脉、抑制交感神经系统兴奋性及拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性，满足了作为治疗心力衰竭药物的多项要求，对治疗CHF具有重要的临床应用价值。本实验应用基因重组腺病毒Ad-hBNP腹腔注射CHF大鼠，观察其对CHF大鼠心肌细胞凋亡因子及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响。

Table 1 The PCR primers and conditions of different genes表1目的基因PCR反应引物序列及实验条件

1 材料与方法

1.1 建立CHF大鼠模型 健康Wistar雄性大鼠40只，8周龄，体质量250～300 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK-（军）2007-004。随机分为正常对照组（10只），假手术组（10只）及模型组（20只）。实验动物适应饲养环境1周后。采用腹主动脉缩窄术法建立CHF大鼠模型。模型组术前禁食，仅给予5%葡萄糖溶液8 h，自由饮用，0.4%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹部正中切口，钝性分离腹主动脉，于右肾动脉分支处上方0.5 cm将腹主动脉挑起，平行放置6号钝针头（直径0.6 mm），结扎，抽出针头，使腹主动脉部分缩窄，狭窄处直径为0.6 mm，确认无出血后，关闭腹腔。假手术组于右肾动脉分支上方0.5 cm处挑起腹主动脉后，只穿线不结扎，余同模型组。术后禁食并予5%葡萄糖溶液12 h，自由饮用，逐渐恢复正常饮食。予以青霉素40万U连续3 d肌内注射以预防感染。术后12周通过超声心动图测定左室舒张末径 （left ventrieular end diastolic dimension，LVEDD）、左室收缩末径（left ventricular end systolic dimension，LVESD）、左室射血分数 （left ventrieular ejection fraction，LVEF）、 左室 短轴缩短率 （left ventrieular fractional shortening，LVFS），比较 3组的上述指标，若模型组的指标与假手术组和对照组差异均有统计学意义，证明CHF造模成功，并据此确定CHF入选标准，获得CHF成模大鼠，用于后续实验。

1.2 慢性心衰大鼠分组及给药方法 另选取符合CHF入选标准的CHF成模大鼠30只，随机分为3组，治疗组 （AdhBNP组）14只，空白腺病毒组（Ad-Track组）8只，生理盐水组 （NS组）8只。Ad-hBNP组予以腹腔注射2.5×1010VP/mL重组腺病毒Ad-hBNP（天津市心血管病研究所）1 mL；Ad-Track组腹腔注射 2.5×1010VP/mL空白腺病毒 Ad-Track 1 mL；NS组腹腔注射生理盐水 1mL，3组均每周注射1次，共4周。另选取10只腹主动脉缩窄假手术大鼠不予以任何处理，作为假手术组。实验大鼠于温度18℃～25℃，湿度40%～60%，12 h明暗交替的环境饲养，予以标准鼠料，自由进食、水。各组动物于给药4周后行RT-PCR检测心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA含量。

1.3 RT-PCR法测定心肌组织 Bcl-2、Bax、Caspase-3及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA含量 右侧颈动脉插管注射10%KCl 2 mL处死大鼠，使大鼠心脏处于舒张期，迅速剖胸，分离心脏，冰生理盐水清洗，滤纸吸干，留取部分心肌组织，-80℃保存。RNAiso Plus试剂（大连宝生物工程有限公司）提取心肌组织中总RNA，在逆转录酶（Promega）的作用下逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，测定相关因子的mRNA表达水平。PCR扩增目的基因片段的引物购自上海生工生物工程有限公司，以GAPDH为内参照，见表1。

PCR在25μL体系中进行，内含60 mmol/L Tris-HCl 1.0 μL，15 mmol/L （NH4）2SO41.0 μL，200 μmol/L dNTP 0.5 μL，0.4 mmol/L目的基因上下游引物各0.5μL和0.08 mmol/L内参基因上下游引物各0.5μL，1 U Taq DNA聚合酶0.25μL，cDNA1.0μL，补水至25μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃ 变性 30 s，62℃/60℃/58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35个循环；72℃延伸7 min。PCR结束后2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，拍照，凝胶成像分析软件测定电泳带的灰度，用目的基因与内参基因电泳条带的灰度比值表示目的基因的相对含量。

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料采用均数±标准差（±s）表示。对计量资料先行正态性检验，符合正态分布的计量资料组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建立CHF大鼠模型 CHF模型组大鼠20只，存活14只，与正常对照组及假手术组比较，模型组大鼠LVEDD及LVESD均增大，LVEF及LVFS均降低（P<0.01），见表2。可见采用腹主动脉缩窄术法能够建立CHF大鼠模型。为确保下一步动物实验研究的可靠性，制定CHF大鼠的入选标准：LVESD>3.2 mm，LVEDD>6.5 mm，LVEF<0.75，LVFS<40%。

Table 2 Results of echocardiographic measurements in three groups表2 各组大鼠超声心动图检测结果 （±s）

Table 2 Results of echocardiographic measurements in three groups表2 各组大鼠超声心动图检测结果 （±s）

*P<0.05，**P<0.01

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2.2 心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA含量 Ad-hBNP组Bcl-2 mRNA表达较Ad-Track组及NS组升高，差异有统计学意义；AdhBNP组、Ad-Track组及NS组的Bax mRNA表达较假手术组升高，差异有统计学意义；Ad-hBNP组Caspase-3 mRNA表达均较Ad-Track组、NS组及假手术组升高，差异有统计学意义。Ad-hBNP组Ⅰ型胶原mRNA表达较Ad-Track组及NS组降低，差异有统计学意义；Ad-hBNP组Ⅲ型胶原mRNA表达较Ad-Track组降低，差异有统计学意义；Ad-Track组与NS组间Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达差异无统计学意义，见表3。

Table 3 The expression of Bcl-2,Bax,Caspase-3 and collagen type I&III mRNA in cardiac myocytes of different groups of rats表3 各组大鼠心肌Bcl-2、Bax、Caspase-3及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达 （±s）

*P<0.05，**P<0.01

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3 讨论

既往认为心力衰竭致病的分子基础是心肌细胞收缩蛋白异常和肌浆网钙摄取紊乱[1]，然而随着对心力衰竭研究的不断深入，诸多研究充分证实心室重构在心力衰竭的发生发展中具有十分重要的作用[2]。心肌细胞凋亡和心肌间质Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积在心室重构中具有重要的作用。细胞凋亡与其相关基因的表达和调节有关，其中 Bax、Bcl-2及Caspase-3是调控凋亡信号途径的重要基因。

本研究发现连续4周Ad-hBNP治疗后，CHF大鼠心肌细胞Bcl-2 mRNA表达较Ad-Track及NS组升高，Bax mRNA表达较Ad-Track及NS组有下降趋势，但差异无统计学意义；Caspase-3 mRNA表达较Ad-Track及NS组均升高。提示BNP对心肌细胞的凋亡具有双重作用。体内实验中，BNP能通过抑制线粒体膜通透性转换孔的开放使心肌细胞免于凋亡和损伤[3]。一些文献也报道不同浓度的BNP对心肌细胞的凋亡具有双重作用，低浓度BNP通过环磷酸鸟苷 （cGMP）途径促进细胞增殖；高浓度的BNP通过非cGMP途径抑制细胞增殖。在急性心肌梗死模型中，短时间地应用低剂量的外源性BNP（0.001～0.01 μg·kg-1·min-1）通过一氧化氮合酶信号通路抑制心肌细胞凋亡来限制心肌梗死面积[4]。兔缺血再灌注模型中，BNP能通过抑制Caspase-3活化和心肌细胞凋亡预防心肌缺血再灌注损伤[5]。然而，D’Souza等[6]证实BNP可影响心肌的重塑。心肌梗死后心肌BNP表达持续增高，持续增高的BNP可抑制成纤维细胞活性和促心肌细胞凋亡，可能是高浓度BNP对细胞增殖的反向调节。BNP具有促凋亡和抑凋亡的双重特性，可能与其实验条件、外源性脑钠素剂量及使用时间等有关。另外，机械牵拉可诱导心肌细胞凋亡，BNP的生理作用能对抗机械牵拉诱导的细胞凋亡，而在体外培养的心肌细胞中这种作用消失，或许可以解释BNP对体外培养的心肌细胞具有促凋亡的作用，而对在体研究的心肌细胞则呈双向作用这一矛盾现象，其机制有待进一步深入研究。

心肌细胞外基质主要由胶原蛋白和纤维连接蛋白等共同形成的一个相互连接的复杂三维网络结构，其主要成分是Ⅰ、Ⅲ型胶原。近年来研究发现，心肌细胞外基质对于维持心脏正常的结构、心肌间力的正常传导及心肌舒缩协调性等具有重要意义。当心肌组织发生病理性变化而出现凋亡或坏死，由于心肌细胞属于终末细胞，不具有再生能力，病变部位的组织将由细胞外基质充填，此时胶原蛋白的生成将会增加，改变了心肌组织正常的结构和功能。本研究发现重组腺病毒Ad-hBNP连续治疗CHF大鼠4周后其Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达均低于Ad-Track组。原因可能是外源性BNP对心肌细胞凋亡调控基因的影响，从而使胶原蛋白的生成趋于正常。

综上所述，外源基因hBNP能影响CHF大鼠心肌细胞凋亡相关基因的表达，减少心肌细胞间质Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。

[1]Hasenfuss G,Reinecke H,Studer R,etal.Calcium cycling proteins and force-frequency relationship in heart failure[J].Basic Res Cardiol,1996,91(Suppl 2):17-22.

[2]Mann DL.Basic mechanisms of left ventricular remodeling:the contribution of wall stress[J].JCard Fail,2004,10(6 Suppl):S202-206.

[3]Sun Y,Deng T,Lu N,etal.B-type natriuretic peptide protects cardiomyocytes at reperfusion via mitochondrial calcium uniporter[J].Biomed Pharmacother,2010,64(3):170-176.

[4]Ren B,Shen Y,Shao H,etal.Brain natriuretic peptide limits myocardial infarct size dependent of nitric oxide synthase in rats[J].Clin Chim Acta,2007,377(1-2):83-87.

[5]Wu B,Jiang H,Lin R,etal.Pretreatment with B-type natriuretic peptide protects the heart from ischemia-reperfusion injury by inhibiting myocardial apoptosis[J].Tohoku J Exp Med,2009,219(2):107-114.

[6]D’Souza SP,Yellon DM,Martin C,etal.B-type natriuretic peptide limits infarct size in rat isolated hearts via KATP channel opening[J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol,2003,284(5):H1 592-600.