高糖高脂饮食诱导大鼠胰岛素抵抗模型和评价

王继勇，高云丽，左 洛，何 敏，陈 聪，李小军

(1武汉理工大学化学工程学院，武汉430070;2中南民族大学药学院，武汉430074)

目前糖尿病的发病率呈持续上升状态，且多以 II型糖尿病为主，而胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是II型糖尿病的重要病理生理基础［1］.胰岛素抵抗是机体在外围组织对胰岛素摄取和清除葡萄糖能力受损［2，3］，导致代偿性胰岛素分泌增多.目前，国内外对于胰岛素抵抗模型建立的方法有自发型［4］，诱导型、转基因型［5］等，其中诱导型动物模型又分为高糖饮食诱导［6］、高脂饮食诱导［7］、药物与饮食联合诱导［4］.据链脲佐菌素(STZ)致糖尿病机理［8］和 STZ 造模的特点［9］，本文采用高糖高脂饮食结合小剂量STZ诱导II型糖尿病胰岛素抵抗，通过体重、空腹血糖、葡萄糖耐量、胰岛素水平、胰岛素抵抗、肝糖原含量等指标评价高糖高脂饮食及STZ对胰岛素抵抗大鼠的影响.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

SPF级雄性 Wistar大鼠，120～150 g，5～6周(湖北省实验动物研究中心，00070294).按照质量比:普通饲料50.0%，淀粉22.5%，蛋白质 11.5%，脂肪10.0%，纤维 2.5%，维生素 0.75%，矿物质2.75%，高温焙干［10］配制高脂高糖饲料.三诺安稳血糖仪与血糖试纸(长沙三诺生物传感技术股份有限公司)，NAVIGATORTMXL电子天平(奥豪斯仪器常州有限公司)，胰岛素测定试剂盒(北京北方生物技术研究所)，肝糖原测定试剂盒(南京建成生物技术研究所)，Eppendorf.AG Centrifuge 5804R 22331 Hamburg(德国 Eppendorf公司)，GAMMA-5射线仪(South Korea SHINJIN MEDICS.INS)，低温大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)，STZ(美国Sigma公司)，葡萄糖、水合柠檬酸、二水合柠檬酸三钠(国药集团化学试剂有限公司).

1.2 实验动物分组

饲养环境温度22～25℃，湿度30%～40%.大鼠适应性饲养3 d后，随机分为3组，每组8只:①正常组，普通饮食;②高糖高脂组，20%果糖水结合高糖高脂饮食;③高糖高脂+STZ组，20%果糖水结合高糖高脂饮食.

1.3 大鼠空腹血糖(FBG)测定和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)

大鼠饲养6周后，禁食不禁水14～16 h，尾部采血，测定空腹血糖，记为OGGT实验0 min的血糖值，随后各组大鼠口服2g/kg的葡萄糖溶液，测30，60，120 min的血糖值，作 OGTT的时间-血糖关系图.

1.4 胰岛素抵抗模型

将0.1 mol/L的柠檬酸溶液与0.1 mol/L的柠檬酸钠溶液按1︰1.32比例混合，调节pH至4.4，配成0.1 mol/L柠檬酸缓冲液，高温灭菌，4℃保存.将STZ溶解于0.1 mol/L的柠檬酸钠缓冲液，配制成浓度为1.2%的STZ溶液.大鼠饲养8周后，禁食不禁水16 h，高糖高脂+STZ组腹腔注射30 mg/kg的STZ溶液，正常组和高糖高脂组注射等剂量的柠檬酸缓冲液.糖尿病大鼠模型的标准为:禁食不禁水14～16 h，检测各组大鼠空腹血糖和葡萄糖耐量，空腹血糖＞7.0mmol/L或120min血糖值＞11.1mmol/L.故确定胰岛素抵抗模型标准为空腹血糖 ＜7.0mmol/L或120min 血糖值 ＜11.1mmol/L，但高于正常值.

1.5 大鼠实验末期 FBG测定及OGTT

大鼠饲养10周后，各组大鼠禁食不禁水14～16 h，尾部采血，测定空腹血糖.由于腹腔注射30 mg/kg STZ的正常大鼠与正常大鼠120 min血糖无显著性差异［11］.故本实验中仅分析正常组、高糖高脂组和高糖高脂+STZ组的葡萄糖耐量情况，具体测定方法同上1.3.

1.6 大鼠胰岛素水平及胰岛素抵抗指数评价

大鼠饲养10周后，各组大鼠禁食不禁水14～16 h，尾部采血1～1.5 mL于含有EDTA抗凝剂的离心管，放于冰水浴中.4℃静置30 min，3500 r/min离心15 min，分离上清，－20℃保存.按照碘［125I］胰岛素放射免疫分析药盒说明书测定各组大鼠血浆胰岛素水平，按照公式［12］胰岛素抵抗指数(HOMAIR)=空腹血浆胰岛素×空腹血糖/22.5，计算胰岛素抵抗指数.

1.7 大鼠肝糖原含量测定

大鼠饲养10周后，各组大鼠禁食不禁水14～16 h，颈椎脱臼处死，解剖取肝脏，计算肝脏指数.取各组大鼠部分肝脏(weight≤100 mg)，迅速放入冰冷的生理盐水漂洗，吸干水分称重，按样本重量:碱液体积=1︰3加入试管，沸水浴20 min，冷却，加蒸馏水(蒸馏水体积=96×肝脏重量)，混匀，沸水浴5 min，冷却，于620 nm波长下，空白管调零，测各管吸光度(OD).按照公式:肝糖原含量(mg/g组织)=测定管OD值/标准管OD值×标准管含量×100×10×1.11，计算大鼠肝糖原含量.

1.8 统计分析

2 结果与分析

2.1 造模结果

按1.4对高糖高脂+STZ组注射STZ 48 h后，8只大鼠中7只造模成功，1只死亡，2周后造模成功大鼠均处于胰岛素抵抗状态.

2.2 大鼠体重变化

各组大鼠造模前皮毛有光泽，精神良好，造模后高糖高脂+STZ组毛发暗黄，精神萎靡，摄食量加大，饮水增多，排尿增多，体重下降，体重变化情况见图1.由图1可见，注射STZ前(1～8周)，各组大鼠体重增加较快.高糖高脂组和高糖高脂+STZ组与正常组相比，均有显著性差异(p＜0.01)，故高脂饲料饮食可使大鼠体重增加，导致肥胖.注射STZ后，高糖高脂+STZ组体重较高糖高脂和正常组增加缓慢，说明STZ在一定程度上阻碍大鼠体重增加.

图1 大鼠体重变化图Fig.1 Body weight changes of rats

2.3 大鼠空腹血糖变化

大鼠空腹血糖变化见图2.由图2可见，注射STZ前(1～8周)，各组大鼠空腹血糖均维持在正常范围(3.2～8.1mmol/L)，无显著性差异，但高糖高脂组和高糖高脂+STZ组FBG略高于正常组.故高糖高脂饮食虽不能造成严重的空腹血糖受损，但在一定程度上使胰岛代偿功能低下，有糖尿病病症的倾向.第9周注射STZ 48 h后，高糖高脂+STZ组中FBG均在10.0 mmol/L以上，高糖高脂+STZ组较正常组和高脂高糖组有显著性差异(p＜0.01);注射STZ 2周后，大鼠FBG虽降至6.4 mmol/L，但较正常组和高脂高糖组仍有显著性差异(p＜0.01)，可见，小剂量的STZ 2周后大鼠糖调节失常，处于高血糖状态.

图2 动物空腹血糖变化Fig.2 Fasting blood glucose changes of rats

2.4 大鼠口服葡萄糖耐量测定

注射STZ前，注射STZ 48 h和2周后，大鼠口服葡萄糖耐量测定结果见图3.

图3 不同时间大鼠注射口服葡萄糖耐量结果Fig.3 OGTT results in rats at different time

由图3可见，整个过程中高糖高脂组的葡萄糖耐量较正常组受损，但无显著性差异.注射STZ前(图3a)各组大鼠在口服葡萄糖30 min后，血糖均明显升高，较0 min有显著性差异(p＜0.01);60 min时血糖明显降低，120 min时，虽血糖值稍高于0 min(0.4 mmol/L)，但已降至正常范围，且无显著性差异.注射STZ 48 h后(图3b)，高糖高脂+STZ组较正常组和高糖高脂组在两组OGTT实验中血糖明显增高，葡萄糖耐量异常显著(p＜0.01).注射STZ 2周后(图3c)，高糖高脂+STZ组在各个时间点血糖值均明显下降约(50±10)%，糖耐量异常有所恢复，因为小剂量的STZ未完全摧毁胰岛β细胞，仍具有分泌能力，随着β细胞功能的逐渐恢复，糖耐量能力也逐渐恢复，保持在胰岛素抵抗状态.

2.5 大鼠肝糖原含量和血浆胰岛素测试

大鼠肝糖原含量和血浆胰岛素测试结果见表1.由表1可见，正常组、高糖高脂组和高糖高脂+STZ组的肝糖原含量无显著性差异.故高糖高脂和STZ对大鼠肝糖原的合成无太大影响.3组的胰岛素水平和胰岛素抵抗指数亦无统计学差异.可见高糖高脂饮食对大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素的功能影响较小，小剂量STZ在一定程度上使该功能略有降低.

表1 各组肝糖原含量、空腹血浆胰岛素水平、胰岛素抵抗指数的测定Tab.1 Determination of the hepatic glycogen contents，fasting plasma insulin level，insulin resistance in each group

正常组、高糖高脂组和高糖高脂+STZ组的胰腺病理切片(20×)见图4.由图4可见，模型组的胰岛较正常组均出现不同程度萎缩(蓝圈标记为胰腺岛所在位置).

图4 各组胰腺病理切片图Fig.3 Pathological section diagrams from rat pancreas of different groups

3 讨论

本研究表明:注射STZ前，高糖高脂组和高糖高脂+STZ组大鼠的体重明显升高(p＜0.05);空腹血糖有不同程度的升高，但无显著性差异;糖耐量略有异常;故短期高糖高脂饮食使大鼠体重增加，血糖升高，由于高糖高脂对胰岛β细胞分泌胰岛素的功能有阻碍，使其分泌胰岛素能力下降.

注射STZ 48 h后，高糖高脂+STZ组的大鼠体重较高糖高脂组增加缓慢，空腹血糖急速上升，糖耐量异常改变，可见STZ可在短时间内破坏胰岛β细胞，使其分泌胰岛素能力骤降，引起血糖骤升.注射STZ 2周后，高糖高脂+STZ组大鼠血糖值较注射STZ 48 h虽均大幅度降低，但较正常组仍有差异(p＜0.05);糖耐量异常程度好转.实验后期，高糖高脂+STZ组大鼠的肝糖原、胰岛素水平和胰岛素抵抗指数与高糖高脂组相比无太大差异，与正常组相比虽略有下降，但无显著性差异.可见短时间内高糖高脂饮食可使空腹血糖升高，但对胰岛β细胞影响不大，小剂量的STZ可在短时间内抑制胰岛β细胞分泌胰岛素的能力，作用迅速但可自行修复，胰岛素敏感性指数虽然降低，但并未影响到肝脏糖代谢功能.

综上所述，高糖高脂饮食虽对大鼠血糖、糖耐量、肝糖原及胰岛素无显著影响，但它可使血糖升高，糖耐量异常，胰岛素减少，肝糖原合成减少.高糖高脂饮食8周，腹腔注射30 mg/kg STZ后，继续高糖高脂2周可形成胰岛素抵抗动物模型.

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