补阳还五汤载药血清对缺氧性神经干细胞增殖和分化的影响

赵舒武 蔡 青 王晓玲 薛 亮

（天津中医药大学中医学院，天津 300193）

神经干细胞可自我更新，并可分化为神经元和神经胶质细胞，与神经损伤后的修复和退行性疾病的治疗密切相关。在神经损伤和神经退行性疾病时，神经组织中的神经干细胞也会受到严重影响。因此，在神经损伤或退行性变时如何保护其内源性神经干细胞免受或减缓损伤，成为一个重要的研究课题。缺氧缺血性脑损伤是最常见的一类神经损伤，是多年来神经科学中的一个研究热点和难点。补阳还五汤是中医治疗脑卒中的经典名方，临床疗效显著。近年来，陆续有人在动物实验中证实补阳还五汤对缺氧缺血性脑损伤有神经保护作用，但对其作用点和作用机制尚不得而知[1-3]。本实验利用体外神经干细胞培养方法，单因素的检测补阳还五汤动物血清对神经干细胞缺氧性损伤的保护作用，并观察其对神经干细胞分化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 孕14d成年未经产Wistar大鼠；（300±15）g，6～8周龄清洁级Wister大鼠，雌雄各半。购自中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001。

1.2 试剂 DMEM/F12（1∶1），B27（Invitrogen），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和多聚赖氨酸（Sigma），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物技术有限公司），四甲基偶氮唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）（Sigma产品）， 兔抗人神经元特异性烯醇化酶（NSE），多克隆抗体、兔抗人胶质纤维酸性蛋白 （GFAP）多克隆抗体PowerVisionTM免疫组化试剂盒和DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），补阳还五汤药物（生黄芪120g、当归尾6g、赤芍5g、地龙3g、川芎3g、红花3g、桃仁3g）来自天津中新药业。

1.3 补阳还五汤载药血清制备 取清洁级Wister大鼠，雌雄各半，根据人和动物体表面积的等效剂量表计算，相当于临床等效剂量，药物浓度0.6g/mL。药物组大鼠给药剂量1mL/100g，早晚各 1次，连续给药 3d，第 4日早晨 1次灌服全天剂量。2h后采血。对照组大鼠给等量生理盐水，以获得对照血清。无菌条件右心房取血，离心管静置6h，取析出血清，1000r/min离心 10min， 收集上清，56℃灭活 30min，-20℃冻存备用。

1.4 实验方法

1.4.1 神经干细胞的培养与鉴定 取孕龄14d的大鼠，颈椎脱臼处死后75%乙醇浸泡消毒3min，无菌条件下取出胎鼠，取大脑皮质并小心剥离软脑膜，冷D-Hank’s漂洗后，用1mL移液枪吹打，机械分散，细胞悬液过75μm筛网，1000r/min离心，弃上清，全培基（2%B27，20μg/L bFGF 的 DMEM/F12）重悬，CO2培养箱中悬浮培养，每3d半量换液，期间每天补加10μg/L bFGF。生长6d后，收集培养的神经球传代，通过acutase酶消化和5号注射器机械分散，使之呈单细胞悬液，进行传代。倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长状况。实验用稳定生长的第3代悬浮神经球。

1.4.2 实验分组 取3代神经干细胞制备单细胞悬液，将载药血清和对照血清用无血清培养基稀释成5%、10%、20%三个浓度梯度，将神经干细胞悬液放入5%CO2、5%O2、饱和湿度的37℃三气培养箱内培养，同时设定相应常规培养箱对照组。每组均设复孔，实验重复3次。

1.4.3 检测指标

1.4.3.1 MTT法检测细胞的活性 将各组细胞以每孔1.0×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积150μL，按照预设条件干预并分别于缺氧0.5h、2h、24h测定OD值。

1.4.3.2 NSE和GFAP的免疫细胞化学染色及计数 将各组细胞接种于6孔培养板中 （预先置涂有多聚赖氨酸的盖玻片），每孔平均接种50个球，静置培养，每3天换液。10d后收集贴有细胞的盖玻片，分别做NSE、GFAP免疫细胞化学染色（采用PV二步法）。每个标本随机取100个视野，普通光镜下观察并计数每个视野的阳性细胞占细胞总数的百分率，取平均值。

1.4.3.3 分化细胞的显微测量 将载药血清和对照血清各组于37℃、5%CO2条件下静置培养，每3天常规换液。分别于接种后5d、7d每孔随机取10个视野测量细胞突起长度。突起长度测量时取最长突起，长度取其平均值（μm）。所测细胞均有晕光。

2 实验结果

2.1 MTT检测 结果见表1。各浓度组载药血清对缺氧神经干细胞均具一定保护作用，最佳干预浓度为10%补阳还五汤载药血清，而5%和20%干预浓度不显著。

2.2 细胞分化比例检测 免疫组化染色及计数结果显示，分化培养5d时，各浓度载药血清组NSE和GFAP免疫阳性细胞数显著多于相应的对照组，10%浓度组比例要高于其他2个浓度组，见表2、表3。

2.3 细胞突起长度显微测量结果 缺氧对照血清组神经球贴壁率低，可见许多细胞团漂浮在培养基中，最终漂浮的细胞团变为细胞碎片（图1-C）。缺氧载药血清各实验组中，部分神经球贴壁困难，一旦神经球贴壁，随即有突起长出，胞体和突起生长较快，可见双突起和多突起细胞；第2日即可见部分细胞建立突触联系；第4日多数细胞可形成较密集网络，胞体较丰满，细胞突起生长快，可见多角形细胞（图1-A、B）。缺氧对照血清组细胞网络稀疏，细胞胞体较小，突起变短、变粗，有的胞体内可见空泡（图1-D）。显微测量结果见表4。

3 讨论

补阳还五汤具有补气活血、通经活络的作用，是中医药治疗脑卒中的经典方剂，其临床疗效显著。动物在体实验已证实，补阳还五汤对实验动物脑缺血灶具有显著神经保护作用，并且发现补阳还五汤能促进并维持大鼠局灶性脑缺血后内源性神经干细胞的增殖，作用机制不明[4-5]。复方中药多经口服发挥治疗作用，其成分复杂，在体内或转化成有效成分，或代谢失活。有人曾用中药的粗提取物用于体外培养实验，但因其成分复杂，对实验结果难以正确判断，且常常难以融入细胞培养基。动物灌服中药后，提取血清用于体外实验是日本学者Hiriko Iwama首先提出并采用的。该方法不仅可以反映药物中可吸收部分的直接作用，也可以反映药物在机体内形成代谢产物和药物诱生的机体内源性物质，因此血清中含有经体内代谢和生物转化的综合有效成分，并且排除了粗制剂中非有效成分对实验结果的干扰，比较真实反映中药的药效和作用[6]。本实验重点研究不同浓度补阳还五汤载药血清对缺氧环境中体外培养的神经干细胞增殖和分化的影响。

表1 补阳还五汤载药血清对各组细胞OD的影响（）

表1 补阳还五汤载药血清对各组细胞OD的影响（）

注：与正常对照组比较，□P＜0.05；与缺氧对照组比较，▲P＜0.05；与缺氧对照血清组1比较，*P＜0.05；与缺氧对照血清组2比较，#P＜0.05；与缺氧对照血清组 3 比较，△P＜0.05。

表2 对缺氧神经干细胞分化为NSE阳性细胞的影响（） %

表2 对缺氧神经干细胞分化为NSE阳性细胞的影响（） %

注：与同组5%血清浓度组比较，□P＜0.05；与同组20%血清浓度组比较，▲P＜0.05。

表3 对缺氧神经干细胞分化为GFAP阳性细胞的影响（） %

表3 对缺氧神经干细胞分化为GFAP阳性细胞的影响（） %

注：与同组5%血清浓度组比较，□P＜0.05；与20%血清浓度组比较，▲P＜0.05。

表4 补阳还五汤对缺氧干预细胞突起长度的影响（） μm

表4 补阳还五汤对缺氧干预细胞突起长度的影响（） μm

注：与相应天数相应浓度对照血清组比较，*P＜0.01。

图1 各组镜下神经球细胞图片

实验结果显示，补阳还五汤载药血清可改善缺氧神经干细胞的生长活性，各载药血清浓度中，10%浓度组明显优于其他干预浓度组，说明补阳还五汤能起到保护和减缓神经干细胞缺氧性损伤的作用，10%浓度组作用效果最为明显。同时我们还发现，补阳还五汤亦可促进缺氧神经干细胞的分化。免疫组化染色并计数结果显示，药物血清组中NSE及GFAP阳性细胞均多于对照血清组，即表明补阳还五汤载药血清亦可促进缺氧环境下神经干细胞的分化。经显微测量显示，缺氧载药血清各浓度组细胞突起明显长于相应的缺氧对照血清组。倒置相差显微镜下观察也发现，载药血清组神经元的形态发育完善，神经元的胞体更加丰满，胞体较大，突起较长，其突起明显长于对照血清组，细胞之间可形成较密集的网络。提示补阳还五汤还可促进分化细胞突起的生长和细胞进一步成熟，对细胞具有营养作用。总之，本实验提示补阳还五汤载药血清可促进缺氧环境下神经干细胞的增殖和分化，并且有利于分化细胞的进一步成熟，尤以10%载药血清组效果最显著，与文献研究结果相符。但补阳还五汤对缺氧环境中神经干细胞的保护作用是如何实现的，其具体作用机制仍未可知。本实验中我们筛选了补阳还五汤载药血清的最佳干预浓度，后续实验将以此为基础从信号通路水平深入探讨该方的作用机制。

[1]陈冬，杨洁红.补阳还五汤抗脑缺血作用的研究进展.中华中医药学刊，2010，28（1）：72

[2]吴常青，汪春彦，邵旭，等.补阳还五汤有效部位对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制.中草药，2011，42（1）：114

[3]许慧娜，陈光明.补阳还五汤对缺血性脑损害神经细胞凋亡影响的研究进展.现代中西医结合杂志，2011，20（12）：1551

[4]孙晋浩，杨琳，高英茂，等.灌服中药补阳还五汤的大鼠血清促进胚胎神经上皮细胞存活与分化的研究.神经解剖学杂志，2003，19（4）：433

[5]刘柏炎，蔡光先，林琳，等.补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血后神经干细胞影响的初步研究.中国临床康复，2004，8（22）：4532

[6]杨彦芳，杨琳.中药复方血清药理学方法评价.中药药理与临床，1999，15（4）：47