猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备和鉴定

李 建，廖园园，朱 微，曹 娟，秦 伟，漆世华，谢红玲，杨 雷

(武汉中博生物股份有限公司，武汉430070)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种高度接触性传染病，又称“蓝耳病”[1]。该病以怀孕母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪呼吸困难、高死亡率和育肥猪呼吸异常为特征，也称“猪不孕与流产综合征”[2]。1992年，欧盟将该病统一命名为“猪繁殖与呼吸综合征”[3]。世界卫生组织(OIE)将该病列入法定通报传染病，我国列为二类动物疫病。

单克隆抗体以其高度均质性、高度特异性、来源稳定等特点，可直接用于疾病的临床诊断，尤其是疑似病例的病毒抗原检测[4]，也可作为原材料广泛应用于多种诊断方法。本文旨在筛选生物活性好、抗体分泌稳定的抗PRRSV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为PRRSV的临床快速诊断商品化试剂的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、细胞、实验动物和其他试剂 骨髓瘤细胞、PRRSV、猴肾细胞(Marc-145)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)均为武汉中博生物股份有限公司保存;8周左右的雌性BALB/c购自武汉生物制品研究所;DMEM培养基(Hyclone公司)、次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶与次黄嘌呤胸腺嘧啶(HT，Sigma公司)、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG(Thermo公司)、异硫氰酸荧光素 (FITC)标记抗鼠 IgG(Thermo公司)、单抗亚类鉴定试剂盒(洛阳赛尔维公司)。

1.2 病毒增殖与纯化 在Marc-145细胞传代后接种PRRSV，置37℃ 5%CO2培养箱中进行培养，待75%以上细胞出现病变(CPE)后收毒，收获后的病毒经超滤浓缩，差速离心，蔗糖密度梯度离心[5]，电镜检测。

1.3 免疫 用纯化的PRRSV与等量的弗氏完全佐剂充分乳化后，采用皮下多点免疫雌性BALB/c小鼠，分别间隔三周用减半剂量加弗氏不完全佐剂进行二免和三免，融合前三天腹腔加强注射。

1.4 间接ELISA筛选方法的建立 采用间接ELISA方法，按方阵法[6]确定包被PRRSV纯化抗原浓度、抗体的最适工作浓度。以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)为底物，测定OD450nm值。以阳性血清OD值在1.0左右，同时与阴性血清OD值差距最大的抗原包被浓度、抗体稀释度为最佳工作浓度。

1.5 杂交瘤细胞株的建立 按常规方法[7]将免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞在50%聚乙二醇进行融合，然后置HAT选择性培养基，将其加入到铺有饲养细胞的96孔板中进行培养，间接ELISA和间接免疫荧光方法进行筛选，有限稀释法连续稀释三次，阳性孔单克隆杂交瘤细胞连续传代3个月。

1.6 腹水的生产及其纯化 选12周龄左右的雌性BALB/c，腹腔注射杂交瘤细胞进行腹水的生产，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水。

1.7 单克隆抗体的鉴定

1.7.1 单克隆抗体的效价 采用已经建立的间接ELISA法测定细胞上清和腹水中单克隆抗体的效价。

1.7.2 单克隆抗体的亚类 用抗原依赖分型法间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清中单克隆抗体的亚类。

1.7.3 杂交瘤细胞的染色体分析 按常规方法[8]对杂交瘤细胞的染色体进行分析，于高倍显微镜下观察，每份样本应计数100个中期完整的核细胞，记录染色体数目的分布。

1.7.4 单克隆抗体的特异性鉴定

1.7.4.1 交叉反应 以PPV、PRV、PCV2为包被抗原，用腹水分别与其进行交叉检测，用间接ELISA检测OD450nm值。

1.7.4.2 间接免疫荧光法(IFA) 用PRRSV接种于含Marc-15细胞的96孔板中，置37℃ 5%CO2培养箱中进行培养72 h后用-20℃丙酮固定。按方阵法[9]确定的腹水、FITC标记的抗鼠IgG的工作浓度和反应时间进行IFA检测，于荧光显微镜下观察。

1.7.4.3 免疫过氧化物酶单层实验(IPMA) 细胞板的制备和固定方法与制备IFA细胞板方法相同。按方阵法[9]确定腹水，HRP标记羊抗小鼠IgG最佳工作浓度和反应时间进行IPMA检测，经3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)进行底物显色，苏木素复染细胞核之后，于显微镜下进行观察。

1.7.4.4 叠加实验 参照文献方法[10-11]进行叠加ELISA实验，并按其公式计算相加指数(AI)。

1.7.4.5 相对亲和力的测定 方法参见文献[12]。

1.7.4.6 单克隆抗体的稳定性检测 获得的2个细胞株经稳定传代后冻于液氮，1个月后复苏，检测细胞上清抗体。再经腹腔注射BALB/c小鼠，同样检测腹水的抗体效价，并与冻存前效价进行比较。

2 结果

2.1 病毒的增殖与纯化 经密度梯度离心之后总计获得2.5 mg的PRRSV病毒，首次免疫剂量为每只50 ug/0.5 mL，电镜结果见图1。

图1 PRRSV电镜图片(箭头所指为PRRSV病毒粒子)

2.2 间接ELISA法工作条件的选择 根据方阵法确定间接ELISA方法最佳的PRRSV包被浓度为1 ug/mL。经间接ELISA法筛选，3次亚克隆共获得2株分泌抗PRRSV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3D10和4H11。

2.3 单克隆抗体的鉴定

2.3.1 单克隆抗体的效价测定 3D10杂交瘤细胞上清的ELISA效价在1∶1024，腹水的ELISA抗体效价在1∶107，IFA效价1∶80;4D11杂交瘤上清的ELISA效价在1∶512，腹水的ELISA抗体效价在1∶106，IFA 效价 1∶40。

2.3.2 单克隆抗的的亚类测定 3D10亚类为IgG1，4H11 亚类为 IgG2b。

2.3.3 杂交瘤细胞的染色体分析 杂交瘤细胞的染色体在90～110范围内变化，平均值在98左右，该数值大于脾细胞染色体数的2倍，小于脾细胞与骨髓瘤细胞染色体数目之和，表明该杂交瘤细胞确实为脾细胞与骨髓瘤细胞融合的产物。

2.3.4 单克隆抗体的特异性鉴定

2.3.4.1 交叉反应 间接ELISA检测结果表明:PPV、PRV、PCV2均不与PRRSV腹水发生交叉反应。

2.3.4.2 IFA试验 腹水1∶1000稀释，FITC标记的抗小鼠IgG1∶100稀释，5株单克隆抗体均能与Marc-145细胞中的PRRSV发生反应，可见接种了PRRSV的Marc-145的细胞膜或胞浆中出现了绿色荧光(图2)，阴性对照未见荧光。

图2 PRRSV单抗免疫荧光图片(400×)

2.3.4.3 IPMA试验 腹水1∶1000稀释，HRP标记羊抗小鼠IgG1∶100稀释，AEC显色，2株单克隆抗体均能与Marc-145细胞中的PRRSV发生反应，可见接种了PRRSV的Marc-145细胞膜或胞浆中出现红色着染(图3)，阴性对照细胞未见阳性反应。

2.4 叠加实验 2株单抗叠加指数为72.91%，大于50%，说明2株单抗识别不同的抗原位点。

2.5 亲和力实验 经非竞争ELISA方法测定3D10的亲和常数6.5×109L/mol，4H11的亲和常数4.0 ×109L/mol。

2.6 杂交瘤细胞的稳定性鉴定 2株杂交瘤细胞稳定传代后冻于液氮，1个月后复苏，细胞生长状态良好，抗体分泌水平与冻存前相同。腹腔接种BALB/c小鼠后可致瘤，并稳定地分泌特异性抗体。

3 讨论

在单克隆抗体制备的实验设计中，确定阳性克隆筛选方法至关重要。间接ELISA方法具有特异性强，灵敏度高，操作简单等优点，而且可以同时检测大批量样品，平行性、稳定性也比较好，已广泛应用于单克隆抗体的筛选与鉴定。本实验用全病毒作为检测抗原的ELISA方法筛选阳性细胞克隆，考虑到免疫原不纯的问题，筛选时采用了交叉筛选的方法。从结果来看，2株单克隆抗体均不与猪其他常见的病毒如PPV、PRV、PCV2发生交叉反应。本研究通过对细胞的克隆化这一关键步骤的把握，使得所制备的单克隆抗体具有阳性克隆多，稳定性好的特点:首先在细胞生长至孔底1/2～1/3时进行克隆，避免了阳性细胞的漏检和染色体丢失情况的发生;采用操作简单的有限稀释法，保证了获得的杂交瘤稳定，抗体分泌效价高;经过3次克隆化获得的杂交瘤阳性率达100%，间接ELISA证明上清效价1∶100，OD 值在1.0 左右，腹水效价 1∶107。

目前，国外应用14株分别针对PRRSV N蛋白、M蛋白、GP3和GP5不同表位的单抗研究了PRRSV的中和表位和ADE表位[13]，发现能够诱导中和抗体的表位存在于M蛋白、GP3蛋白和GP5蛋白，而诱导ADE表位主要是N蛋白。本试验研制出的2株单抗已经证实识别不同抗原表位，但具体识别哪种蛋白表位还需进一步验证。下一步，将应用本研究制备的2株PRRSV单克隆抗体建立免疫酶和免疫荧光方法，作为PRRSV临床快速诊断方法的补充和验证。

[1]黄佳佳.猪繁殖与呼吸综合症的防治[J].中国畜牧杂志，2006，42(24):60-62.

[2]Andreyev V G，Wesley R D，Mengeling W L，et al.Genetic variation and phylogenetic relationships of 22 porcine porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)field strains based on sequence analysis of open reading frame 5[J].Arch Virol，1997，142:993-1001.

[3]Wensvoort G，Kluyver E P.Lelystad virus，the cause of porcin ecpidemic abortion and and respiratory syndrome:a review of mystery swine disease research at lelystad[J].Vet Microbiology，1992，33:185-193.

[4]郭宝清，陈章水，刘文清，等.从疑似 PRRS流产胎儿分离PRRS的研究[J]. 中国畜禽传染病，1996，87(2):1-4.

[5]杜念兴.兽医免疫学[M].第二版.北京:中国农业出版社，1997.

[6]焦新安，刘秀梵.实验手册.江苏农学院传染病教研组，1990:39-50.

[7]刘秀梵.单克隆抗体在农业上的应用[M].合肥:安徽科学技术出版社，1994:32-36.

[8]章谷生，容秉培.单克隆抗体在医学上的应用[M].上海科学技术出版社，1987.

[9]曹雪涛.精编免疫学实验指南[M].北京:科学出版社，2009.

[10]崔尚金，王云峰，王翠兰，等.应用单克隆抗体进行兔轮状病毒的抗原分析[J].中国兽医科技，1997，27(5):24-25.

[11]刘 洁，何文辉，李晶梅，等.分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立[J].中国兽药杂志，2013，47(7):9-12.

[12]Macdonald R A，Hosking C S，Jones C L.The measurement of relative antibody affinity by ELISA using thiocyanateelution[J].J Immuno Meth，1988，106:191.

[13]Dea S，Gagnon C A，Mardassi H，et al.Antigenic variability among North American and Eurpean strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as defined by monoclonal antibodies to the matrix protein[J].J Clin Microlo，1996，34(6):1488-1493.