丹酚酸B通过Akt－eNOS通路对大鼠心肌缺血／再灌注损伤保护作用的研究＊

周 丹 权 伟 关 月 朱艳荣 郭 超 王艳华 奚苗苗 文爱东

第四军医大学西京医院药剂科 （西安710032）

缺血性心脏病是当今世界威胁人类健康的首敌。随着冠状动脉内溶栓和冠脉搭桥等内外科治疗手段的广泛应用，继之出现的心肌缺血／再灌注 （myocardia1ischemia／reperfusion，MI／R）损伤日益受到心脏病学家的高度重视。中药治疗MI／R损伤疗效确切、前景良好。许多从中药中分离得到的化合物都具有抗MI／R损伤的作用，其中对于丹参心肌保护作用的研究最为引人关注。

丹参（Radix Salviae Miltiorrhizae）为唇型科植物丹参的干燥根及根茎。丹参的有效成分复杂，主要有丹参酚、丹参素、丹参酮等。现代医学研究发现，丹参的不同提取物具有抗氧化、抗炎、扩血管、抑制凋亡等作用［1－4］。丹酚酸 B（Salvianolic acid B，Sal B）是丹参的水溶性成分，有研究表明Sal B对大鼠MI／R损伤具有保护作用［5，6］，但其分子作用机制尚不明确。本实验通过复制大鼠 MI／R损伤模型，观察Sal B对大鼠 MI／R损伤的保护作用，并进一步研究Akt－eNOS通路在Sal B心肌保护中的可能作用，为Sal B用于MI／R损伤的防治提供新的理论依据。

1 材 料 1.1 实验动物及分组 清洁级雄性健康SD大鼠40只，体质量250～270g，购自第四军医大学动物中心。动物分笼饲养（环境温度24℃，湿度60%～70%），术前12h禁食，自由饮水。将大鼠随机分为4个组，即假手术组、模型组、Sal B低及高剂量组，每组10只。

1.2 主要药品与试剂 Sal B（贵州迪达科技有限公司）；肌酸激酶同工酶（creatine kinase－MB，CK－MB）（上海西唐生物科技有限公司）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；2，3，5－氯化三苯基四氮唑蓝（Tetrazolium chloride，TTC）染色剂（中国医药集团上海化学试剂公司）；伊文思蓝（Evans Blue，EB）（美国Sigma－Aldrich公司）。RIPA buffer蛋白裂解液和苯甲基磺酰氟化物（碧云天生物技术研究所）；兔抗鼠Akt和p－Akt（Ser473）单克隆抗体、兔抗鼠eNOS和p－eNOS（Cell Signaling Technology公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔IgG（北京中山生物技术公司）；ECL底物发光显色试剂盒（HRP发光）（北京雷根生物技术有限公司）。

1.3 主要仪器 HX－100E小动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；TDZ4A－WS低速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；COOLPIX S1型照相机（Nikon公司，日本）；680型酶标仪、电泳仪、转膜仪、凝胶成像仪（BIO－RAD公司）；5417型低温高速离心机（Eppendorf公司）。

2 方 法 2.1 给药方法 假手术组和模型组大鼠均于再灌注开始时经颈静脉给予生理盐水（2mL／kg）；Sal B低、高剂量组大鼠均于再灌注开始时经颈静脉给予Sal B溶液（20，60mg／kg）。

2.2 造模方法 大鼠称重后，2mL／kg腹腔注射3%戊巴比妥钠，仰卧位固定，连接心电图监测，气管插管并接呼吸机（频率：75次／min；潮气量：8～9mL；吸：呼＝1：2），胸骨左缘旁纵行切开第3～5肋间做横行切口，剪开并挑起心包，暴露心脏，以左心耳与肺动脉圆锥交界处的左冠状动脉前降支（Left anterior descending coronary aery，LAD）为标志，于左心耳下方1～2mm处进针、穿线（横跨左冠状动脉前降支），将一小硅胶管从丝线两端穿入，稳定10min后结扎，缺血30min后，再灌注3h结束。成功标准［7］：结扎LAD后心电图II导联ST段出现弓背向上抬高，T波高耸等为缺血成功；放松结扎线后，抬高的ST段下降1／2以上为再灌注成功。假手术组动物只穿线，不结扎，其余两组均进行30min缺血和3h再灌注。

2.3 心肌梗死面积测定［8］再灌注3h后，再次结扎各组大鼠左冠状动脉前降支，从颈动脉迅速注入3%EB溶液2 mL，待大鼠口唇及四肢末梢皮肤蓝染后迅速摘除心脏，滤纸吸除心室腔中残余染液，－80℃冻存。取出后自心尖向心底平行房室沟方向将其切成相等厚度的5片，2%TTC溶液（pH＝7.4）37℃孵育10min，4%多聚甲醛固定过夜。染色后白色代表梗死区（area of necrosis，AN），红色代表缺血但未梗死区，蓝色代表正常区，危险区（area at risk，AAR）为红色和白色面积之和［9，10］。采用Image－Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析。梗死程度采用梗死区面积（AN）与危险区面积（AAR）的比值表示。

2.4 血清生化指标测定 再灌注3h后，腹主动脉取血，分离血清，离心（4000r／min）12min，试剂盒检测 CK－MB和LDH的活性。

2.5 Akt、p－Akt及eNOS、p－eNOS蛋白表达测定 每组取4只大鼠，实验结束后迅速剪取左心室前壁心肌组织，立即放入－80℃冰箱中保存。标本取齐后在冰上剪碎、加入适量的裂解液提取心肌总蛋白，4℃下20000g离心20min，取上清，放入－20℃冰箱中备用。Western blot检测 Akt、p－Akt及eNOS、p－eNOS蛋白表达。取等量蛋白进行SDS－PAGE电泳分离，转至PVDF膜。室温封闭1h后，加入相应兔抗鼠一抗（Akt 1：1000，p－Akt 1：1000或 p－eNOS 1：1000，eNOS 1：1000），4℃ 孵育过夜。加入羊抗兔HRP标记二抗（1：2000稀释），室温孵育1h。加入ECL显色液，曝光显影，凝胶成像分析系统摄像分析。

3 结 果 3.1 Sal B对缺血／再灌注大鼠心肌梗死面积的影响 大鼠缺血30min再灌注3h后，模型组动物心肌出现明显的梗死，梗死区面积与危险区面积的比为（58.09±2.76）%。与假手术组相比，模型组动物心肌梗死面积显著增加（P＜0.05），提示 MI／R损伤模型制作成功。而Sal B低、高剂量组梗死区面积与危险区面积的比分别为（40.41±4.26）%，（29.99±5.41）%。与模型组相比，Sal B低、高剂量组（20，60 mg／kg）均能明显降低 MI／R损伤大鼠心肌梗死面积（P＜0.05，P＜0.05），见图1。

图1 Sal B对MI／R损伤大鼠心肌梗死面积的影响。△P＜0.05vs假手术组；▲P＜0.05vs模型组

3.2 Sal B对缺血／再灌注大鼠血清CK－MB和LDH的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清CK－MB和LDH水平明显增加（P＜0.05）。Sal B高剂量组大鼠血清CK－MB和LDH水平明显下降，与模型组相比有统计学差异（P＜0.05）。Sal B低剂量组大鼠血清LDH水平明显下降，与模型组相比有统计学差异（P＜0.05），而Sal B低剂量组大鼠血清CK－MB水平有下降趋势，但与模型组相比没有统计学差异（P＞0.05），见表1。

表1 Sal B对大鼠心肌梗死面积、血清CK－MB和LDH的影响（±s，n＝10）

表1 Sal B对大鼠心肌梗死面积、血清CK－MB和LDH的影响（±s，n＝10）

注：△P＜0.05vs假手术组；▲P＜0.05vs模型组

组别 剂量（mg／kg） CK－MB（ng／mL） LDH（U／L）假手术组 ／24.26±6.30 29457.50±663.06模型组 ／ 88.51±32.20△ 62961.12±3506.10△Sal B低剂量组 20 63.83±29.85◇ 41429.33±5759.77▲Sal B高剂量组 60 27.71±8.52▲ 29822.17±1709.51▲

3.3 Sal B对缺血／再灌注大鼠心肌 Akt、p－Akt及eNOS、p－eNOS蛋白表达的影响 Western blot检测显示，各组Akt、eNOS蛋白表达均无明显差异（P＞0.05）。与假手术组比较，模型组p－Akt／Akt及p－eNOS／eNOS相对灰度值增加（P＜0.01），提示 MI／R损伤可引起p－Akt及p－eNOS蛋白表达升高。与模型组比较，Sal B低、高剂量组 p－Akt／Akt及 p－eNOS／eNOS相对灰度值均显著增加（P＜0.01），表明Sal B低、高剂量组（20，60mg／kg）均可增加Akt及eNOS的磷酸化水平而使其活化，见图2。

图2 Sal B对MI／R损伤大鼠心肌Akt、p－Akt及eNOS、p－eNOS蛋白表达的影响。△P＜0.01vs假手术组；▲P＜0.01vs模型组

4 讨 论 随着溶栓、冠状动脉搭桥术、经皮冠状动脉内成形术等血管再灌注疗法的应用，可通过恢复缺血组织的供血有效挽救濒死心肌［11］。但是再灌注受缺血组织血管再通时间限制并存在再灌注损伤等问题。大量报道表明，心肌缺血期间的一些变化已为再灌注损伤的发生奠定了基础，再灌注损伤是缺血损伤的延续、扩大和恶化［12］。因此，寻找能够有效防治MI／R损伤的药物成为医药学家的研究热点。越来越多的证据表明，Sal B对MI／R损伤具有保护作用，但其具体分子机制不清。本研究在观察Sal B对MI／R损伤保护作用的基础上，进一步探讨了Akt－eNOS信号通路在其中的关键作用。

梗死面积被认为是衡量MI／R损伤的金标准［13］。由于心肌梗死是不可逆损伤，通常采用AN／AAR百分比来说明缺血／再灌注的损伤程度。在各组大鼠缺血程度基本一致的情况下，AN／AAR百分比越大，说明心肌梗死面积越大，心肌损伤程度越严重。本实验结果显示，Sal B能显著减少心肌梗死面积，并且随浓度升高梗死面积明显下降，提示Sal B对MI／R损伤大鼠的心肌具有保护作用。长期心肌缺血会导致心肌梗死、心肌细胞死亡，心肌缺血时，心肌酶CK－MB和LDH被认为是心肌细胞受损程度的重要标志酶［14］。心肌细胞受损后，血清中CKMB和LDH的水平明显升高。本实验证明，Sal B 60mg／kg可显著抑制MI／R大鼠血清LDH和CK－MB水平的增加，Sal B 20mg／kg可显著抑制 MI／R大鼠血清LDH水平的增加，进一步提示Sal B对MI／R损伤大鼠的心肌具有保护作用。

Akt－eNOS是再灌注损伤补救酶（RISK）信号转到通路的组成之一［15］，通过影响下游相关蛋白的表达，对心脏产生保护作用。该通路有多种效应分子，而Akt处在这一通路的中心环节，也是最主要的靶酶，只有磷酸化的Akt才能具有抗凋亡、蛋白合成及促细胞生存等活性［16］。研究表明缺血再灌注时eNOS可发挥保护作用，eNOS的高表达参与血流的调节，抑制血管痉挛、减少炎性细胞的浸润及防止细胞内钙超载等再灌注损伤的关键环节［17］。高峰［18］等人发现胰岛素可激活 PI3K－Akt－eNOS信号通路，活化的Akt可使eNOS磷酸化激活，进而增加NO的生成、抑制TNF－α的生成，从而减轻 MI／R损伤引起的炎症反应，达到保护心脏的作用。本研究发现Sal B 20 mg／kg和60mg／kg均可增加Akt及eNOS的磷酸化水平而使其活化，由此可推断出Sal B激活Akt－eNOS信号通路，使效应蛋白Akt磷酸化增多，进一步激活了下游靶目标eNOS使其磷酸化，从而发挥其对心脏的保护作用。

综上所述，本研究结果提示Sal B可通过激活Akt、eNOS的磷酸化而减轻大鼠 MI／R损伤，但是Akt－eNOS信号通路是通过何种机制被激活以及该通路活化后如何发挥心肌保护作用，还有待进一步研究。

［1］Wang JG，Jiang FL，Feng J.et al.Study of inhibition of TanshinoneⅡA on hypertrophy and apoptosis of cardiomyocytes induced by AngⅡ［J］.China Journal of Modern Medicine，2007，17（18）：2202－2204.

［2］Ding M，Yuan YJ.Study on the mechanisms of an extract of Salvia miltiorrhiza on the regulation of permeability of endothelial cells exposed to tumour necrosis factor－alpha［J］.J Pham pharmacol，2007，59（7）：1027－1033.

［3］尹晓敏，彭解英，高义军，等.丹参对槟榔碱诱导血管内皮细胞凋亡和Caspase－3活性的影响［J］.中国现代医学杂志，2005，l5（9）：1368－1370.

［4］Yin XM，Peng JY，Gao YJ，et al.Effect of salvia miltiorrhizae injection on apoptosis of endothelia cells induced by areoline and activity of Caspase－3［J］.China Journal of Modern Medicine，2005，15（9）：1368－1370.

［5］赵桂峰，张红霞，范英昌.丹酚酸B对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用［J］.辽宁中医学院学报，2004，6（1）：55－56.

［6］张 良，袁冬平，徐 立，等.丹酚酸B对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制研究［J］.中药新药与临床药理，2008，6（19）：467－469.

［7］陈玉培，牟崇明，季道如，等.参附注射液预干预对大鼠心肌缺血／再灌注损伤的保护作用［J］.重庆医科大学学报，2005，30（2）：220－228.

［8］Hangaishi M，Nakajima H，Taguchi J，et al.Lecithinized Cu，Zn－superoxide dismutase limits the infarct size following ischemia－reperfusion injury in rat hearts in vivo［J］.Biochem Biophy Res Commun，2001，285（5）：1220－1228.

［9］Sodha NR，Clements RT，Feng J，et al.The effects of therapeutic sulfide on myocardial apoptosis in response to ischemia－reperfusion injury［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2008，33（5）：906－913.

［10］Osipov RM，Bianchi C，Fcng J，et al.Effect of hypercholesterolenfia on myocardial necrosis and apoptosis in the setting of ischemia－reperfusion［J］.Circulation，2009，120Suppl l1：S22－S30.

［11］张鹏程，柯永胜.心肌缺血再灌注损伤进展［J］.国际老年医学杂志，2010，5（31）：210－214.

［12］Schulze CJ，Wang W，Kumari R，et al.Imbalance between tissue inhibitor of metallopreteinas～－4and matrix metallopreteinases during acute myocardial correction of myocardial ischemia－reperfusion injury ［J］.Circulation，2003，107（19）：2487－2492.

［13］Mauro P，Claudio C，Graziella B，Paffaele G，et al.Single－Point Cardiac Troponin T at Coronary Care Unit Discharge after Myocardial Infarction Correlates with Infarct Size and Ejection Fraction［J］.Clinical Chemistry，2007，48（9）：1432－1436.

［14］Valko M，Leibfritz D，Moncola J，et al.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease［J］.J Biochem Cell Biol，2007，39（1）：44－52.

［15］Tsang A，Hausenloy DJ，Mocanu MM，et al.Postconditioning a form of“modifier reperfusion”protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol－3－kinase－Akt pathway［J］.Circ Res，2004，95（3）：230－232.

［16］Lindsley CW，Barnett SF，Layton ME，et al.The PI3K／Akt pathway：recent progress in the development of ATP－competitive and allosteric Akt kinase inhibitors［J］.Curr Cancer Drug Targets，2008，8（1）：7－18.

［17］Brunner F.Maier R.Andrew P，et al.Attenuation of myocardial ischemia／reperfusion injury in mice with myocytespecific overexpression of endothelial nitric oxide synthase［J］.Cardiovasc Res，2003，57（1）：55－62.

［18］Li J，Zhang HF，Gao F，et al.Insulin inhibits tumor necrosis factor－induction in myocardial ischemia／reperfusion：Role of Akt and endothelial nitric oxide synthase phosphorylation＊ ［J］.Crit Care Med，2008，36（5）：1551－1558.