表达M2e－EYFP融合蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫生物学特性分析

李秋明，张 嵩，李 喆，刘贤勇

（1.中国农业大学动物医学院，北京 海淀100193；2.北京农学院动物科学技术学院，北京 昌平102206）

目前正在研制或已经研制成功的鸡球虫疫苗可分为鸡球虫常规活疫苗（强毒和弱毒疫苗）和基因工程疫苗两大类。其中基因工程疫苗主要由亚单位疫苗、核酸（DNA）疫苗和活载体重组疫苗构成。活载体重组疫苗又可分为两种形式，一种是以细菌或病毒为载体的球虫抗原重组疫苗；另一种是以活球虫为载体将其他病原微生物有效抗原转入球虫基因组中，通过球虫的常规感染激发球虫免疫应答，同时诱发对其他疾病的保护。后者的设想由索勋（2006）提出，并申请专利－球虫的新用途［1－2］。目前该项研究已经取得重大进展，本文即是对已经获得的表达M2e－EYFP融合蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫（以下简称转基因球虫）生物学特性进行分析，并与其受体－野生型柔嫩艾美耳球虫（以下简称野生型球虫）相比较，为转基因球虫及其产品的安全性评价奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 野生型球虫，鸡柔嫩艾美耳球虫北京株（WildEimeriatenellaBJ，Et－W）。 转 基 因 球 虫（TransgenicE.tenellaBJ，Et－T），是以野生型球虫为载体通过限制性内切酶介导的整合方法（REMI）获得的表达融合M2e－EYFP（禽流感病毒基质蛋白胞外结构域－增强型黄色荧光蛋白）蛋白的单孢子囊筛选后的子代卵囊。

农大3号雄性鉴别雏鸡，无球虫饲养至试验所需日龄时使用。昆明系小鼠、家鸽市购，于实验室条件下观察一周后使用。

1.2 方法 卵囊形态、大小和最小潜在期检测：转基因球虫和野生型球虫卵囊各测量250个，每个卵囊测量最长和最宽值（单位μm），平均长度与平均宽度的比值为卵形指数，用于判断卵囊形态。最小潜在期为粪便中最早见到第一批子代卵囊的时间［3］。检测方法参见孔繁瑶（1997）和索勋（1998）中的描述［4－5］。

繁殖力检测：球虫的繁殖能力通常用口服已知数量的卵囊所产生的总卵囊数来表示［5］。方法：转基因球虫和野生型球虫卵囊分别感染7日龄雏鸡15只，5只/笼，三个重复组。剂量1 000个孢子化卵囊/只。感染后自最早产出卵囊时开始每隔24h收集1次全部粪便，采用麦克马斯特氏法（Mc－Master method）计数卵囊产量，连续7d［4，6］。

卵囊排出显露期检测：10只7日龄雏鸡随机分成两组，笼上饲养，分别感染转基因球虫和野生型球虫卵囊，剂量1 000个孢子化卵囊/只。感染后第5天开始每天更换鸡笼直至试验结束。感染后第13天开始，每日采用麦克马斯特氏法检查卵囊排出情况，直至不能检测到卵囊为止。

最短孢子化时间检测：在Norton（1983）方法的基础上改用盲肠卵囊收集法迅速获得卵囊［7］。操作如下：转基因球虫和野生型球虫感染鸡分别于感染后第8天剖杀收集盲肠粪便卵囊，麦克马斯特氏法计数卵囊浓度，并用2.5%重铬酸钾液调整至50 000个卵囊/mL，取100mL卵囊液放入250mL三角瓶中于振荡器中孢子化（温度28℃，转速130 r/min离心），以上过程要求在半小时内完成。自入振荡器中开始计时，于孢子化第10小时开始每隔1 h感染3只无球虫鸡，直至孢子化第19小时。雏鸡感染后第7天剖杀，盲肠抹片镜检是否有卵囊产出，以最早检出卵囊的感染用卵囊的孢子化时间为最短孢子化时间。

寄生宿主和寄生部位的特异性、致病性和免疫原性观察：120只21日龄试验鸡逐只称重，随机分组，10只/组，笼上饲养。分别感染转基因球虫和野生型球虫卵囊，剂量为200、500、1 000、10 000个和50 000个孢子化卵囊/只，同时设空白对照组和不感染攻毒组。另外，200～1 000个剂量组每组增加感染5只，单笼饲养用作剖杀记盲肠病变分。感染后第7天逐只称重，10 000个和100 000个剂量组鸡全部剖杀，200～1 000个剂量组剖杀单笼饲养的雏鸡，被剖杀鸡记盲肠病变分，其余未剖杀鸡继续饲养留作免疫原性试验。盲肠病变记分按Johnson和Reid（1970）设计的病变记分法进行［8］。致病性试验结束后，剩余鸡继续饲养，一周后，除空白对照组外全部攻毒，剂量50 000个孢子化卵囊/只。攻毒后密切观察临床症状，一周后逐只称重，记盲肠病变分和检测盲肠卵囊总产量。

另外，转基因球虫和野生型球虫分别对10只小鼠和5只家鸽进行高剂量（50 000个孢子化卵囊/只）接种，感染后第7天开始每隔1天进行粪便中卵囊产出情况的检查，同时密切观察临床症状1个月。

2 结果

卵囊形态大小、最小潜在期、繁殖力、卵囊排出显露期和最短孢子化时间：结果见表1。数据显示，转基因球虫和野生型球虫的卵囊大小和卵囊产量存在显著差异，最小潜在期和卵囊排出显露期亦具波动性。转基因球虫的最小潜在期139h，野生型球虫126h。转基因球虫从感染后第6天开始，最短至第16天，最长至第19天可以检出卵囊；而野生型球虫卵囊可以检出的时间稳定在感染后6～14d。

表1 转基因球虫和野生型球虫的卵囊形态大小、最小潜在期、卵囊产量、卵囊排出显露期和最短孢子化时间检测

寄生宿主和寄生部位的特异性：转基因球虫和野生型球虫高剂量接种的非靶动物小鼠和家鸽自感染后第7天至1个月后粪便中均未检出鸡球虫卵囊。所有动物未见异常临床症状，直至试验结束时全部存活。但两种球虫对鸡具有明显的致病性，不同感染剂量致病力有差异性，尤其高剂量组甚至引起鸡死亡（见表2）。剖杀鸡肠道抹片镜检卵囊显示两种球虫寄生部位均为盲肠及附近肠组织，十二指肠、小肠黏膜抹片镜检未见卵囊。

致病性和免疫原性：转基因球虫和野生型球虫对鸡增重和盲肠病变的影响及致死率见表2。数据显示，两种球虫200～1 000个孢子化卵囊/只剂量组感染鸡的增重与空白对照组相比差异不显著，高剂量组差异显著（10 000～50 000个孢子化卵囊/只），但是两种球虫相同剂量组间增重差异不显著。盲肠病变分和死亡率方面，二者也存在一定差异，尤其是转基因球虫致死率明显高于野生型球虫。

表2 转基因球虫和野生型球虫对鸡的致病性

免疫原性试验结果见表3。数据显示，转基因球虫和野生型球虫各感染组鸡增重与空白对照组相比差异不显著，与不感染攻毒组相比差异显著。各感染组间盲肠卵囊数量尽管存在差异，但与不感染攻毒组相比均呈显著差异，且各感染组无1只鸡死亡，说明转基因球虫和野生型球虫一样具有良好的免疫原性。

表3 转基因球虫和野生型球虫对鸡的免疫原性

3 讨论

通过相关文献资料可知，艾美耳球虫卵囊形态大小具变异的可能性，最小潜在期亦存在株间差异［3－5，9－14］。林瑛（1998）指出，建立 1个株的初次纯种分离（或单卵囊分离）的时机对球虫的潜在期会有很大影响，如果初次分离是在感染鸡的排卵囊初期，则这些球虫的后代会像其原代一样，潜在期较短；反之，初次分离时已过排卵囊高峰期或在排卵囊末期，则这些球虫的后代潜在期会相对较长［11］。球虫卵囊产量的多少与多种因素密切相关，包括感染虫株种类、感染剂量和 鸡的品 种、年龄等［5，10，15－16］。已知转基因球虫是经过单孢子囊筛选后获得的子代卵囊，筛选具随机性，选取的卵囊在排卵囊期的时间点不确定，如果挑选的是排卵囊初期的卵囊，则其无论大小还是最小潜在期等都会与排卵囊后期的卵囊存在一定差异。因此推断单孢子囊筛选是引起转基因球虫和野生型球虫株间差异的主要原因。

众所周知，柔嫩艾美耳球虫的所有发育阶段只在盲肠或盲肠附近的肠组织内完成，通常不会对除了鸡以外的其他动物构成威胁［3，5］。转基因球虫亦具备这种生物学特点，且高剂量感染时只寄生于鸡的盲肠组织，亦不感染小鼠和家鸽。但在致病性和免疫原性方面转基因球虫又与野生型球虫存在一定的差异，主要表现在死亡率和免疫后抑制卵囊产量上。Long（1973）指出，分离到的同一种虫体或虫株其毒力不同；Dikovskata（1974）也报道，不同地区13株柔嫩艾美耳球虫的致病力不同，这些虫株间感染鸡的死亡率变动范围大（12.5%～80%），并且转基因球虫的死亡率与等剂量感染时我国某山西株的死亡率接近，因此研究中转基因球虫和野生型球虫死亡率之间表现的差异也不足为奇［3，17］。另外，Shirley等（1996）用核酸探针杂交技术证实，以单个孢子囊感染鸡所得的后代群体是遗传性状完全一致的克隆群体，也即是说研究中使用的转基因球虫遗传性状单一，因此其在免疫原性试验中表现的抑制卵囊产量弱于野生型球虫的结果也是不难理解的。

综上所述，转基因球虫与野生型球虫间表现的部分差异应是艾美耳球虫株间差异的体现，尽管二者存在一定的差异，但是它们的生物学特性仍然具有较高的相似性，且符合柔嫩艾美耳球虫生物学特性。这里还需要提及的是，转基因球虫与野生型球虫在致病性方面表现的差异在实验室获得的另一株转基因球虫上亦有体现［18］。因此，综合分析得出，转基因球虫研制成功后可考虑在卵囊排出显露期的不同时间点进行单孢子囊筛选，各自获得子代卵囊后再混合使用，以增加转基因球虫的遗传多样性，降低与受体的差异。

［1］ 索勋，王晓佳，刘贤勇，等.球虫的新用途：中国，200710－064924.8［P］.2010－08－18.

［2］ Suo X，Wang X，Liu X，Shi T，etal.球虫的新用途：中国，US8，142，771B2［P］.2012－03－28.

［3］ 彼得L·朗.球虫生物学［M］.蒋金书，刘钟灵，陆信武，译.南宁：广西科学技术出版社，1990.

［4］ 孔繁瑶.家畜寄生虫学［M］.2版.北京：中国农业大学出版社，1997.

［5］ 索勋，李国清.鸡球虫病学［M］.北京：中国农业大学出版社，1998.

［6］ Haug A，Williams R B，Larsen S.Counting coccidial oocysts in chicken faeces：a comparative study of a standard McMaster technique and a new rapid method［J］.Veterinary Parasitology，2006，136（3－4）：233－242.

［7］ Norton C C，Chard M J.The oocyst sporulation time of Eimeria species from the fowl［J］.Parasitology，1983，86（2）：193－198.

［8］ Johnson J，Reid W M.Anticoccidial drugs：lesion scoring techniques in battery and floorpen experioments with chickens［J］.Exp Parasital，1970，28：30－36.

［9］ Jeffers T K.Attenuation of Eimeria tenella through selection for precociousness［J］.The Journal of parasitology，1975，61（6）：1083－1090.

［10］韩静芳，董辉，黄兵，等.鸡球虫早熟株的选育及孢子化卵囊大小测定［A］.中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术讨论会论文摘要集［C］.长春：中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会，2006：55.

［11］Long P L，Johnson J K.Eimeria of American chickens：characterstics of six attenuated strains produced by selection for precocious development［J］.Avian Pathology，1988，17：305－314.

［12］段嘉树，张翠红，郭荣华，等.柔嫩艾美尔球虫和毒害艾美尔球虫早熟弱毒株的致病性和免疫原性研究初报［J］.当代畜牧，1993，4：21－23.

［13］王仲兵，古少鹏.柔嫩艾美耳球虫的分离鉴定与致病性测定［J］.中国动物检疫，2010，27（9）：36－38.

［14］林瑛，徐卫东.鸡球虫潜隐期影响因素分析［J］.辽宁畜牧兽医，1998，1：29－30.

［15］段嘉树，李秋明，于占芳.不同日龄雏鸡对柔嫩艾美球虫早熟株卵囊的易感性及免疫力［J］.中国兽医科技，1999，29（1）：9－10

［16］段嘉树，李秋明，William Wong.The Influence of Host Age on the Infectivity of Precocious lines of Eimeria and the Clinical Immunity in chicks［J］.Acta Parasitol Med Entomol Sin，2001，8（3）：135－139.

［17］古少鹏，韩春来，郑明学，等.柔嫩艾美耳球虫山西分离株的分离与致病性观察［J］.寄生虫与医学昆虫学报，2008，15（2）：65－69.

［18］闫文朝，王天奇，索勋，等.表达黄色荧光蛋白和乙胺嘧啶抗性基因的转基因柔嫩艾美耳球虫的发育和致病性分析［J］.畜牧兽医学报，2009，40（12）：1794－1798.